AFLP分子标记技术的发展及其在海洋生物中的应用

来源：保捱科技网

第26卷第1期　　　　　　　　　　海　洋　水　产　研　究　2005年2月　　　　　　　　MARINEFISHERIESRESEARCH

Vol.26,No.1Feb.,2005

・综述・

王伟继1　岳志芹2　孔　杰1　王清印1

(1中国水产科学研究院黄海水产研究所,青岛266071)

(2中国海洋大学海洋生命学院,青岛266003)

摘　要　　AFLP分子标记技术是一种建立在PCR技术和RFLP标记基础上的新的DNA指纹技

术,具有多态性丰富、结果稳定可靠、重复性好、所需DNA量少,且可以在不需预先知道基因序列的情况下进行研究等特点,现已被广泛应用于遗传图谱构建、遗传多样性分析、系统进化及分类学、遗传育种和种质鉴定以及基因定位等方面。本文简要介绍AFLP分子标记技术的原理、特点、发展及其在海洋生物中的应用现状及前景展望。

关键词　　AFLP　　分子标记　　海洋生物中图分类号　Q7　　　文献识别码　A　　　文章编号　100027075(2005)0120080206

DevelopmentofAFLPanditsapplicationinmarineorganismWANGWei2ji1　YUEZhi2qin2　KONGJie1　WANGQing2yin1

(1YellowSeaFisheriesResearchInstitute,ChineseAcademyFisherySciences,Qingdao266071)

(2OceanUniversityofChina,MarineLifeCollege,Qingdao266003)

ABSTRACT　　AFLP(AmplifiedFragmentLengthPolymorphism)isoneofthenewlydevel2opedDNAfingerprinttechniquesbasedonPCRandtheRFLP(RestrictionFragmentLengthPolymorphism)techniques.Highpolymorphisms,goodreproducibility,lowusageofDNAtemplateamountandnorequirementofpriorknowledgeofgenomesequencesareadvantagesofAFLP.AFLPhasbeenappliedwidelyinconstructionofgeneticlinkagemap,assessmentofge2neticpolymorphism,pedigreeanalysis,breedingpracticeandgenepositioning.Inthispaper,theprinciple,characteristicsofAFLPanditsapplicationsinmarinebiologywereintroducedanddiscussed.

KEYWORDS　　AFLP　　Molecularmarker　　Marineorganism

　　AFLP(AmplifiedFragmentLengthPolymorphism)———扩增片段长度多态性技术,又称为SRFA(Se2lectiveRestrictionFragmentAmplification),是由荷兰Keygene公司科学家ZebeauMarc和VosPieter等发展起来的一种检测DNA多态性的新方法,于1993年获得欧洲专利局专利。AFLP结合了RFLP的稳定性和PCR技术的高效性,同时又避免了RFLP受探针的因素,因而可产生丰富而稳定的遗传标记,被认为是一

国家863青年项目(2002AA628070)和国家863项目(G2003AA603021)共同资助收稿日期:2003210213;接受日期:2004203203

作者简介:王伟继(19722),男,助理研究员,主要从事海洋生物遗传育种学和分子生物学研究.

E2mail:wangwj@ysfri.ac.cn,Tel:(0532)5823291

　第1期　　王伟继等:AFLP分子标记技术的发展及其在海洋生物中的应用

种理想有效的分子标记技术,现已被广泛应用于遗传图谱构建、遗传多样性分析、系统进化及分类学、遗传育种和种质鉴定以及基因定位等方面。

1　AFLP分子标记的原理和特点

AFLP(Vosetal.1995)是建立在RFLP基础上的选择性PCR,其原理是将DNA进行性酶切,再将

特定的接头连接在酶切片段的两端,形成一个带接头的特异性片段,以此为模板,以接头序列和性内切酶的切点序列为基础设计引物,进行PCR扩增。关于AFLP分子标记原理详尽的介绍的综述较多(尹佟明1997)。AFLP分子标记的特点主要表现在:信息量大、多态性丰富、灵敏度高、可重复性强,不需要预先知道研究对象的遗传背景,分析所需DNA量少,受反应条件影响不大。理论上讲,由于AFLP分析采用的性内切酶及选择性碱基是大量的,因而能够产生的标记是无限的。一般每个AFLP反应可检测的位点多达50～100个,提供的信息量大;结果稳定可靠并呈典型的孟德尔遗传,而且扩增片段大多与基因组单一位置相对,可

以用做遗传图谱和物理图谱的位标。由于AFLP技术具有上述特点,在生物的遗传多样性分析、种质鉴定、标记辅助育种、基因定位、遗传图谱的快速构建、基因表达与以及分类进化研究等领域得到了广泛的应用。

2　AFLP分子标记的发展

2.1　性内切酶组合的发展及改进

对于较复杂的基因组,AFLP技术一般采用两种性内切酶,一种为寡切点酶,一种为多切点酶,通过二者的搭配,可以控制产生合适的片断的数量和大小,保证在电泳可以分辨的范围内。目前在性内切酶的组合方面有了一定的变化。

2.1.1　SADF单性酶切选择性扩增片断万春玲(1999)等采用单酶切水解家蚕基因组DNA,经过1次PCR扩增,用小面积聚丙烯酰胺凝胶检测

扩增产物,取得了很好的效果,并且使AFLP操作更为简便、经济。2.1.2　TE2AFLP三性内切酶

TE2AFLP(ThreeEndonuclease2AFLP)(vanderWurffetal.2000),是用两种寡切点酶(通常为6碱基位点识别酶)和1种多切点酶(通常为4碱基位点识别酶)混合酶切,DNA被切断产生6种具有不同末端的性片段(若用A、B、C3种酶,则产生AA、BB、CC、AB、AC、BC片段),这些片段仅用与寡切点酶所切片段末端具有共同粘性末端的两个人工接头连接。选择后的粘性末端序列和接头序列作为PCR反应的引物结合点,再在引物末端加1～2个选择性核苷酸进行扩增。TE2AFLP由于第3种内切酶的介入,差异筛选效率提高,指纹带数量相对减少和带型分布更均匀,更适用于基因组大而复杂的生物(肖兴国　2001)。2.2　检测方法的改进

最早的AFLP检测方法是使用放射性同位素自显影,由于对环境及人体的危害性,并且需要配套的防护措施及仪器设备,放射性同位素操作不便,了该方法的应用。目前己发展了银染及荧光检测,其灵敏度和安全性大大提高。2.2.1　银染

Cho(1995)在水稻的AFLP分析中对银染法和放射性同位素检测法进行了比较,发现两种方法得到的AFLP图谱完全一致,通过对特异性片断的克隆和测序发现二者的序列也相同。银染技术所需时间短(从电泳到最后的带型显现仅需半天时间),凝胶自然干燥后可长期保存,而且可以直接从胶板上切取目的条带以进行扩增和克隆(李传友　1998),因此目前国内实验室普遍采用银染这一检测方法。2.2.2　荧光扩增片断长度多态性(FAFLP)

荧光扩增片断长度多态性是利用荧光染料标记引物从而得到带标记的产物,再用自动化测序仪进行检测。该方法的灵敏度比放射性同位素和银染法都高,被广泛应用于动植物和微生物的遗传变异、分子病理学及标记

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图谱等的研究。2.3　cDNA2AFLP技术

AFLP分析的模板可以是基因组DNA,也可以是cDNA,后者因为与基因的表达密切相关,因此可利用cDNA2AFLP研究基因的表达与。cDNA2AFLP的反应机理及流程与基因组的分析基本相同,但也有一

些差异。因为cDNA的片断通常远远小于gDNA,因此选择性扩增所用的引物一般含1～2个选择性碱基。cDNA2AFLP通常用于从基因家族中分辨高度同源性的基因以及研究真核生物中不同基因和基因表达的时空性。Bachem等(1996)首次应用cDNA2AFLP技术观察了土豆块茎形成过程中的基因表达,研究了储存蛋白Patatin和编码ADP2葡萄糖焦磷酸化酶基因转录水平的表达变化,cDNA2AFLP分析揭示的结果与Northern分析的结论一致,证实了cDNA2AFLP研究发育基因的可行性。Qin等(2000)利用cDNA2AFLP策略研究了土豆胞囊线虫Globodetarostochinensis致病性,讨论了cDNA2AFLP在植物2微生物互作研究中的应用。目前国内在水稻(杨　玲　2003)、小麦(陈桂平　2003)、棉花(肖月华　2002)、马铃薯(周志钦　2001)、花椰菜(李　凌　2000)等植物中已开展了利用cDNA2AFLP技术研究抗旱性、耐盐性、抗病虫性、发育不同时期基因表达等的研究,取得了一定的成果。

3　AFLP分子标记在海洋生物中的应用

AFLP具有灵敏度高、信息量大、呈孟德尔遗传等特点,且不需预先知道研究生物的遗传背景,因此受到了

海洋生物广大研究人员的青睐,在生物学的各个领域得到了广泛应用。3.1　群体遗传结构分析

AFLP信息量大、灵敏度高、能够检测亲缘关系非常近的材料之间的差异,因此利用AFLP分析海洋生物

的遗传多样性水平,对海洋种质资源保护、遗传育种具有理论指导意义。

杨　锐(2001)研究了浙江不同地理群体(普陀列岛、渔山列岛、南麓列岛)及福建坛紫菜(Porphyrahai2tanensis)遗传多样性,指出遗传距离与地域分布呈正相关;在对野生型和养殖型的分析中,找到了与叶片厚薄性状相关的特异分子标记。潘　洁等(2002)研究了栉孔扇贝(Chlamysfarreri)中国长岛群体、韩国东西部群体的遗传多样性,指出中国群体与韩国群体的遗传差异较大,并找到了3个地理群体的特征性标记。Kusumo(2000)研究了翅藻(Alariamarginata)不同采样时间、地点的遗传差异。利用AFLP指纹图谱,分布相距几分米及大于100km的个体都能够被区分,遗传相似度变化范围为76%(相距几分米)、71%(相距15m)、67%(相距185km),遵循遗传距离与分布距离呈正比的关系,并且AFLP图谱随采样时间的不同而呈现季节性差

异。Chapman(2000)研究了头泡藻(Cephaleurosvirescens)的3个地理群体的AFLP,从中得到了与有性生殖机制相关的数据。孙　易(2000)利用RAPD和AFLP技术对来自15个种及品系的卤虫进行了研究并聚类分析,对其分类地位进行了探讨。3.2　基因的表达与研究

主要是通过cDNA2AFLP分析,研究基因不同时空的表达,它降低了经典mRNA差异显示技术的假阳性率,同时对低水平表达基因更敏感,并使操作更安全。在水产生物中,Rubinstein等(2000)进行了斑马鱼的cyc野生型及cyc突变体的cDNA2AFLP分析,发现了两个新基因:Crestin和Calreticulin,并研究了它们在不同组织及发育时期的表达。

3.3　遗传育种操作效应监测、种质鉴定

在遗传育种过程中,经常采用杂交、人工雌核发育(Gynogenesis)等方法来获得所需优良性状的后代,而对育种结果进行鉴定的传统方法是肉眼检测可变性状或蛋白电泳检测标记,具有信息量少、准确性低、依赖基因表达,受外来环境因素影响较大的缺点。而AFLP分子标记是中性选择的,因此可用于研究亲本对后代群体

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种质的贡献及基因追踪等方面,如Felip等(2000)通过AFLP指纹图谱研究了舌齿鲈(Dicentrarchuslabrax)的孤雌生殖,准确鉴定了雌核发育的成功率。Congiu(2001)鉴定了纳氏鲟(Acipensernaccarii)和美洲鲟(A.transmontanus)杂交种。Liu(1998)对两种鲇鱼(Ictaluruspunctatu,I.frucatus)亲本及其杂交后代进行了遗传分析,结果表明,种内多样性较低,而种间遗传多样性较高;正反杂交后代的AFLP指纹图谱类似,AFLP标记呈现孟德尔遗传,并发现了两个比预期出现频率低得多的遗传标记,可能与实验材料是进行快速生长性状筛选的群体有关,因此它们可能是与生长速度负相关的标记。同时,AFLP技术可以用来在品种选育过程中对后代的遗传结构变异规律进行预期,万俊芬(2004)利用AFLP技术对不同亲本数的鲍鱼后代遗传结构变异规律进行了分析,结果发现亲本数目减少会导致后代低频率位点的丢失和基因频率的漂移。岳志芹(2004)①利用AFLP分子标记对中国明对虾四代抗WSSV选育群体进行了遗传结构分析,其遗传多样性指数在四代选育群体中没有明显的变化,说明在连续选育的过程中,有效避免了瓶颈效应和遗传漂变。但是发现了规律性递增或递减的9个位点,分析这些位点应该和抗WSSV性状有一定的相关性。3.4　遗传连锁图谱的构建

遗传连锁图谱的构建是遗传学研究的一个重要领域,它在分子标记辅助育种、基因定位与克隆、比较基因组作图等方面有重要的应用价值。因为AFLP技术呈孟德尔遗传,一次反应可以检测大量的多态位点,且不需预先知道研究对象的遗传背景,因此在遗传背景了解相对较少的海洋生物中,被广泛应用于连锁图谱的构建。

Kocher(1998)利用来自一雌性鱼的41个单倍体胚胎,构建了罗非鱼(Orechromisniloticus)的遗传连锁图谱,其中包含62个微卫星标记,112个AFLP标记,共30个连锁群,覆盖了全部22条染色体704cM的遗传距离。加利福尼亚大学的Agresti(2000)采用三向(3waycross)杂交莫桑比克罗非鱼×(蓝帚齿罗非鱼×尼罗罗非鱼)〔(Orechromismossambicus)×(O.aureus×O.niloticus)〕的方法,构建了亲本的连锁图谱,其中莫桑比克罗非鱼的图谱包括14个连锁群,长514cM,含有13个微卫星及49个AFLP标记,而蓝帚齿罗非鱼×尼罗罗非鱼的杂交一代的雄性亲本含有24个连锁群,60个微卫星及154个AFLP标记共1632cM的遗传距离。

Young(1998)利用加倍单倍体(DH)构建了虹鳟(Onchorhynchusmykiss)的连锁图谱,476个分子标记〔包括AFLP,VNTR,SINE(Sequencesfrominterspersednuclearelements)〕将基因组分成31个主连锁群和11个小连锁群,估计基因组大小为262715cM,他在其中一连锁群上发现性别决定位点,并指出AFLP多分布于连锁群的中心位置,而VNTR多分布于端部。Linder(2000)以细鳞大麻哈鱼(Onchorhynchusgorbuscha)

的四分体为材料,采用着丝粒连锁分析,研究了312个位点的重组率,发现AFLP分子标记靠近着丝点附近,成簇存在。日本比目鱼(Paralichthysolivaceus)遗传连锁图谱在2003年也有报道(Mariaetal.2003),该图谱包含AFLP分子标记352个,微卫星标记111个,借助连锁图谱,作者研究了比目鱼的性别重组率,这是比目鱼类首张遗传连锁图谱的报道。在鲇鱼等生物中,AFLP标记用于连锁图谱构建的可行性也有探讨(Liuetal.1998)。在虾类中,Moore等(1999)利用全同胞家系246个多态性的AFLP标记,构建了具有44个连锁群的日本对虾(Penaeusjaponicus)AFLP图谱,这是甲壳动物首次报道的连锁图谱。该遗传连锁图谱的构建工作在2003年又有了新的进展,Li(2003)分别构建了43个连锁群的日本对虾父本和31个连锁群的母本AFLP分子标记遗传连锁图谱,尤其值得一提的是首次将性别相关的分子标记定位到日本对虾雌虾的遗传连锁图谱。斑节对虾(Penaeusmonodon)连锁图谱构建完成,该图谱包括了116个AFLP标记,包含了20个连锁群,覆盖了1412cm的遗传距离(Wilsonetal.2002)。作为我国北方重要的海水养殖品种,中国明对虾(Fenneropenaeuschinesnsis)AFLP分子标记遗传连锁图谱构建最近也取得了进展,岳志芹等(2004)获得了中国对虾低密度的遗传连锁图谱,其中,父本74个标记,25个连锁群,母本66个分子标记,22个连锁群。软体动物中,牡蛎的AFLP分子标记遗传连锁图谱的构建最近也有报道,李　莉(2003)将RAPD和AFLP两种分子标记整合到一张遗传连锁图谱上,分别构建了牡蛎雌性和雄性的遗传连锁图谱,该图谱一个明显的特点是标记分布均匀。

①岳志芹,王伟继,孔　杰,戴继勋.2004.用AFLP方法分析中国对虾抗病选育群体的遗传变异.水产学报(待刊)

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AFLP分子标记在连锁图谱上的分布并不是均匀的,有成簇存在的现象,值得指出的是,由于AFLP为显

性标记,图谱与图谱之间的通用性较差,因此,有必要结合其他的分子标记,如微卫星、EST等分子标记,丰富和完善已有的连锁图谱。

4　小结

AFLP分子标记由于其独特的优点,被应用于海洋生物研究的各个方面,但是目前多集中于遗传多样性的

调查、遗传图谱的构建等理论研究方面,随着海洋生物分子生物学研究的进一步深入,AFLP分子标记在基因定位与克隆、分子标记辅助育种等实践应用方面中有广阔的前景。

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