CYP450工作开展计划

CYP450工作开展计划

一、 菘蓝细胞色素 P450 的基因组学分析

1.菘蓝P450 基因的鉴定

从 NCBI 和 P450数 据 库下载其他植物如拟南芥、水稻、番茄等已报道的 P450 基因数据。根据植物 P450 基因的分类原则, 每个亚家族选择代表性的 P450 蛋白质序列与菘蓝基因组数据进行 BLASTN 比对。参照国际上关于 P450 命名的权威数据对菘蓝中的 P450 基因进行命名。

2.菘蓝P450系统进化树的构建

通过MUSCLE对所鉴定的P450氨基酸序列比对, 利用MEGA 5.2软件测试菘蓝P450基因的氨基酸序列构建系统发育树的最佳模型, 根据最佳模型, 分别采用MEGA 5.2软件中最大似然法)和mr-bayes软件贝叶斯法构建系统进化树。

3.多序列比对及二级结构元件分析

对预测的 P450 蛋白序列每个家族选择代表性成员使用 ClustalX(1.83)软件进行多序列比对。将已知的拟南芥AtAOS(CYP74)序列结构作为基础, 与预测的烟草 P450 代表性序列进行多序列比对。并以AtAOS 的二级结构作为模板标明二级结构元件。

4.菘蓝 P450 基因表达谱分析

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利用 Cluster 3.0进行层次聚类分析, Treeview 软件对数据结果进行可视化。使用RNA 快速提取试剂盒提取菘蓝不同时期各器官的 RNA。并使用反转录试剂盒将RNA 反转录为 cDNA, 进行 RT-PCR 分析。

二、 菘蓝靛蓝合成候选CYP450基因克隆及表达模式分析

1. 候选基因的筛选

分析不同诱导子处理下菘蓝中CYP基因家族成员的表达变化，与HPLC法测定的相同条件下菘蓝中靛蓝含量比较，筛选与靛蓝合成密切相关的CYP基因作为候选基因。

2. 候选CYP450基因及启动子区的克隆

采用Primer 5.0 软件设计引物在 gDNA 和 cDNA 水平上进行 PCR 和 RT-PCR，获得该基因的 DNA 全长和开放阅读框（ORF）。在全长序列的基础上设计引物 GSP1、GSP2、GSP3 和 GSP4，联合接头引物 AP1 和 AP2，通过 BD Genome Walker获得 5’启动子区。

3. 候选基因序列和蛋白的生物信息学分析

4. 用 BLAST和 DNAStar 寻找 ORF 并翻译。通过 GSDS 在线工具分析候选基因结构。采用 ExPASy-ProtParam分析蛋白质的理化性质；ExPASy-ProtScale分析蛋白质的亲疏水性；TMHMM分析蛋白质的跨膜结构域；SOPMA 分析蛋白质的二 级结构；SWISS-MODEL分 析 蛋 白 质 的 三 维 立 体 结 构 ； TargetP和 NucPred分析蛋白 质 的 亚 细 胞 定 位 。 运 用 PlantProm-TSSP和 PlantCARE分析启动子区的顺式作用

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元件以及预测转录起始位点 。通过 MEGA4.0 邻接法构建系统树。

5. 候选基因表达模式分析

qPCR 分析候选基因在不同部位和不同诱导条件下的表达。

6. 候选基因在靛蓝合成过程中的功能验证

构建CYP基因的干涉和过表达载体，并对菘蓝进行转化。

7. 候选基因编码蛋白细胞色素P450单加氧酶活性检测

将含候选基因的载体质粒转入大肠杆菌，检测其是否具有细胞色素P450单加氧酶活性。

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