血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳的影响因素分析

第１Ｏ卷第３期　实验科学与技术　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ＶｏＬ　１０　Ｎｏ．３　２０１２年６月　Ｊｕｎ．２０１２　血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳的影响因素分析　程（１．四川理工学院驰　一，赵兴秀　６４３０００；２．四川大学生命科学学院，成都６１００６４）　生物工程学院，四川　自贡摘要：血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳常因多种因素影响而出现区带分离不清晰、拖尾、区带歪斜、区带呈锯齿状或弯曲等现　象。该文结合教学实践，对造成不理想电泳图谱常见影响因素进行分析，提出相应的解决方法，有助于改进实验教学效果。　关键词：醋酸纤维素薄膜电泳；血清蛋白；影响因素；对策　中图分类号：Ｑ一３３；Ｑ５　文献标志码：Ｂ　ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７２—４５５０．２０１２．０３．００９　Ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ　ｏｎ　Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ　Ｆａｃｔｏｒｓ　ｏｆ　Ｓｅｒｕｍ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　Ｅｌｅｃｔｒ０ｐｈ０ｒｅｓｉｓ　ｏｎ　Ａｃｅｔａｔｅ　Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ　Ｍｅｍｂｒａｎｅ　ＣＨＥＮＧ　Ｃｈｉ　，ＺＨＡＯ　Ｘｉｎｇ—ｘｉｕ　（１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｓｉｃｈｕａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅ＆Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｚｉｇｏｎｇ　６４３０００，Ｃｈｉｎａ；　２．Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓｉｃｈｕａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｅｎｇｄｕ　６１００６４，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｃｏｍｍｏｎ　ｐｒｏｂｌｅｍｓ　ｓｕｃｈ　ａｓ　ｕｎｃｌｅａｒ　ｚｏｎｅ　ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ，ｔｒａｉｌｉｎｇ，ａｓｋｅｗ　ｚｉｇｚａｇ　ｏｒ　ｃｕｒｖｅｄ　ｚｏｎｅｓ　ａｒｅ　ｏｆｔｅｎ　ｅｎｃｏｕｎｔｅｒｅｄ　ｉｎ　ｅｌｅｃｔｒｏ—　ｐｈｏｒｅｓｉｓ　ｏｆ　ｓｅｒｕｍ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｎ　ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ　ａｃｅｔａｔｅ　ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｄｕｅ　ｔｏ　ｖａｒｉｏｕｓ　ｆａｃｔｏｒｓ．Ｃｏｍｂｉｎｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｔｅａｃｈｉｎｇ　ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｓｕｃｈ　ｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒｓ　ａｒｅ　ａｎａｌｙｚｅｄ　ｉｎ　ｄｅｔａｉｌ　ａｎｄ　ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ　ｍｅａｓｕｒｅｓ　ａｒｅ　ｐｕｔ　ｆｏｒｗａｒｄ．Ａｌｌ　ｏｆ　ｔｈｅｓｅ　ｗｉｌｌ　ｈｅｌｐ　ｔｏ　ｉｍｐｒｏｖｅ　ｔｈｅ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｔｅａｃｈｉｎｇ　ｅｆｆｅｅｔ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ａｃｅｔａｔｅ　ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ　ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ；ｓｅｒｕｍ　ｐｒｏｔｅｉｎ；ｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒ；　电泳是生物化学的一项基本技术。因具有吸附　血时　一Ｂ桥融合为一个波峰…。琼脂糖凝胶电　少、电渗作用小、快速省时和成本低等优点，以醋　泳结果显示，血红蛋白会迁移到　一球蛋白和　酸纤维薄膜为支持物进行电泳分离血清蛋白已成为　一球蛋白区带之间，从而使后两者的检测结果增　生化教学必开的基础实验项目之一。但影响该实验　高，所以应取用无溶血的血清标本。以笔者所在的　的因素较多，往往因考虑不周而得不到理想的电泳　生化实验室为例来描述血清标本的制备，即取洁净　图谱，主要表现为区带分离不清晰、拖尾、区带歪　的１００　ｍＬ离心管到菜市接取健康兔血后，常温静　斜、区带呈锯齿状等。笔者结合生化实验教学经验　置至血液凝固，５　０００　ｒ／ｍ，离心５　ｍｉｎ，上清液即　及他人研究工作，对影响实验效果的常见因素进行　为血清，小心移取分装，一２０￣Ｃ冻存备用。实验结　分析并提出相应对策，以供参考。　果表明，血清蛋白分离效果良好。　１　电泳实验准备中的影响因素　血清蛋白中除清蛋白外，其他的大多数都是糖　蛋白＿２　Ｊ。这些糖蛋白通过Ｎ一或０一连接的寡糖链　１．１　血清标本溶血或陈旧　增强了蛋白分子空间构象的稳定性，在一定程度上　正常情况下，血清蛋白电泳后分离成５个较明　提高了抵抗蛋白水解酶的能力，半衰期延长　ｊ。　显的条带：清蛋白、　一球蛋白，仅　一球蛋白，ｐ　尽管在２℃～８℃保存，血清中多种酶的存在仍会　一球蛋白和　一球蛋白。但溶血标本则表现为清蛋　分解蛋白，尤其像清蛋白这样缺乏对酶抵抗力血清　白含量下降，　一球蛋白和ｐ一球蛋白含量升高且　蛋白，使血清蛋白质的组分发生改变，蛋白质的分　区带分离不清，随溶血程度的增加，血红蛋白浓度　解同时也引起电荷下降，使　一球蛋白的电泳速　达到２．５０　ｇ／Ｌ时，仅　一球蛋白和Ｂ一球蛋白区带　度变慢＿４　Ｊ。研究表明，血清在２℃～８℃的条件下　重叠，呈现出电泳扫描图中的仅　一Ｂ桥，严重溶　保存４８　ｈ对电泳结果影响较小；在３～５　ｄ内，除　一收稿日期：２０１２—０２—２１；修改日期：２０１２—０３—１２　球蛋白外，其他４种蛋白的质量百分比均出现　作者简介：程驰（１９７５一），男，在读博士研究生，实验　了显著性变化（Ｐ＜０．０５）　Ｊ。在笔者实际教学　师，主要研究方向：分子免疫学、动物传染病　中，发现血清在一２０℃下冻存７　ｄ也未见降解，但　和微生物学。　分装保存在４℃的血清确实最好在２　ｄ内使用才能　第１０卷第３期　程驰，等：血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳的影响因素分析　・２５・　保证分离效果。　１．２电泳缓冲液　血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳对缓冲液的ｐＨ　值和离子强度要求严格。离子强度愈低，区带展开　愈长，电泳速度愈快，带电颗粒在介质上扩散严　重，可分辨性明显降低，区带展开延长，导致区带　拖尾ｌ６一　。当离子强度低于０．０５时会出现区带拖　尾现象，高于０．０７５时，区带则过于紧密。虽然交　换电极或是将缓冲液混合后滤过再使用有一定改善　作用，但应该经常测试缓冲液的ｐＨ值和离子强　度，尤其是阳极端的ｐＨ值变化，而且最好在电泳　６次后就更换新的缓冲液　。　研究发现，在相同条件下，采用与巴比妥一巴　比妥钠缓冲液ｐＨ值和离子强度相同的硼酸缓冲液　能得到更清晰的图谱，表明这样的硼酸缓冲液是一　种更经济环保的替代溶液¨　。　如果对血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳实验的要求　不高，像笔者所在的地方理工高校所开设的生化实　验，只要求得到５条清晰可辨的蛋白区带即可。若　要进行病理分析或得到更多区带的话，可基于不连　续缓冲系统的原理，以氯离子作为前导离子，巴比　妥离子作为后向离子，所产生的较大电势梯度使血　清样品浓缩，血清蛋白分辨率可大大提高，非病理　血清即可分出６—８条明显区带¨　。　２点样时的影响因素　２．１醋酸纤维薄膜　厚薄不均，糙面微孔不均，脆性不一的纤维素　膜将导致区带泳动速度稳定，蛋白质在白色斑点处　甚至不泳动而造成区带分离不清晰，出现区带跑歪　的现象。因此应选用漂浮于缓冲液后能迅速浸润且　色泽一致的薄膜。浸泡充分的薄膜如果过湿则会因　样品扩散迅速，浓度降低而导致区带分散不集中。　因此，在用滤纸轻吸膜片表面多余缓冲液时，应以　不干不湿为宜，因为吸得太干的薄膜（醋酸纤维薄　膜出现白斑）渗透性会变差，样品不易进入醋酸纤　维素网孔内而达不到分离量。　２．２点样　从人为因素来看，因点样造成的蛋白分离失败　所占比例最高。点样量太多时容易导致电泳图谱分　离不良或产生拖尾现象；点样量太少，区带则模糊　不清¨　。点样失败，一方面是点样器自身缺陷；　另一方面同时也是主要方面，即熟练度不够。用载　玻片端面点样，会因其宽度略大于薄膜宽度而产生　明显的边缘效应，并有拖尾现象。如采用改制较窄　的订书针端面或毛细管点样，效果明显优于载玻片　端面点样¨　。在实验教学中，笔者用宽度打磨成　１．５　ｅｍ左右的盖玻片采用印章法点样的效果也不　错。点样时力度不均或蘸取样品太多，在膜上分布　不匀会引起区带歪斜或边流，因此要求学生在滤纸　上多练习点样是十分必要的。　另外，点样时还应辨别光泽面和无光泽面。若　点在光泽面上，血清不能渗入醋酸纤维薄膜微孑Ｌ　内，将导致电泳图谱不清晰。笔者在准备时提前在　干膜片光泽面的一端标上序号，无光泽面标上＋　号，并提醒学生注意在这＋号面画线点样，这样就　不易混淆，也便于实验评分。　３　电泳时的影响因素　３．１　搭桥　薄膜在滤纸桥上的位置歪斜会引起区带歪斜和　边流。当薄膜两端与盐桥接触不紧密，存在小缝　隙，薄膜不同位置电阻不一致而导致电流强度不　同，出现同一区带的不同位点的迁移速度差异而造　成锯齿状区带；当膜两端与盐桥接触程度不同时就　会出现歪斜和边流。此外，由于膜的扩散作用和边　缘效应，搭桥时薄膜相互挤靠也会引起区带跑歪的　现象。因此，搭桥时薄膜与电流方向平行并与滤纸　桥接触紧密，并保证上样点位置悬空，不与阴极盐　桥相重叠，因为来自电极缓冲液的流动会改变部分　低荷质比血清蛋白的电泳行为＿】　。但通常电场力　决定蛋白质电泳行为，缓冲液流动对蛋白质电泳行　为影响太小而难观察到¨　Ｊ。搭桥后还应盖上电　泳槽盖平衡１０　ｍｉｎ，以保证薄膜湿度均匀。　３．２电泳电压与电流　电压及电流的正确选择对于区带的清晰分离十　分必要。电压过高，虽可缩短时间，但图谱展开距　离短，蛋白质各组分之间出现挤压，区分困难；反　之，以低电压进行电泳时，样品泳动速度慢并且容　易扩散，图谱常出现拖尾现象。　影响质点迁移率的因素有多种，包括带电质点　的性质、电场强度、缓冲液的黏度、温度、ｐＨ值　和离子强度以及固体支持物的电渗现象等。由于醋　酸纤维薄膜电渗很小，假定缓冲液性质稳定，此时　影响质点迁移的主要因素便是电场强度。电泳速度　与电场强度和电流强度成正比，　电压增加，电流也　相应增大，从而加速电泳。但电流过大时，血清蛋　白运动快但区带却分不开，产生的热效应足够高的　・２６・　实验科学与技术　２０１２年６月　话甚至会使血清蛋白变性而不能分离¨　。有资料　认为，实际操作时应根据具体的电泳设备性能，按　电场强度６—８　ｍＶ／ｃｍ长（指薄膜与滤纸桥总长　度），０．４～０．８　ｍＡ／ｃｍ宽（薄膜数目的总宽度）来　设定电压，以控制电流效果在１０　ｍＡ为佳。也有　研究采用先细调到０．４　ｍＡ／ｃｍ膜宽，然后电泳１Ｏ　ｍｉｎ，再调到０．６　ｍＡ／ｃｍ膜宽，然后电泳７０　ｍｉｎ，　可得到清晰可见的电泳图谱¨　。此外，还应根据　室温对电压适当调整¨　驯。　４染色与漂洗中的影响因素　染色与漂洗充分与否也会影响蛋白区带的清晰　程度。由于清蛋白在血清蛋白中的含量高，染色时　间短会造成清蛋白区带中间色浅的现象。染色液重　复使用次数过多或存放时间过长以及薄膜粘黏，也　会使蛋白区带染色不均，出现空泡样。染料配制过　程中，将氨基黑１０　Ｂ的用量增加３０　并贮存较长　时间再用会提高染色效果，但需振摇染色充分。　实践表明，将染色充分的薄膜依次在盛有漂洗　液的三个培养皿中分别来回漂洗几次，将减少脱色　时长。虽然研究认为温度提高会加快蛋白质的洗　脱，但漂洗温度不应超过２５％。实际操作发现，　若无定量要求，一般情况下，室温漂洗并不影响区　带的清晰度　。　５　结束语　尽管血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳实验的影响因　素较多，但在实际操作中，只要结合生物化学理论　知识和对电泳原理的深入理解，就能够及时准确地　分析问题的原因并对实验操作和器材进行调整，得　到良好的实验结果。　参考文献　［１］梁惠强，牛映红，梁佩婵．溶血因素对血清蛋白电泳　结果的影响分析［Ｊ］．现代预防医学，２０１１，３８（５）：　９３９—９４１．　［２］祝其锋．生物化学［Ｍ］．修订版．武汉：湖北科学出版　社，１９９９：８５—８９．　［３］Ｄｗｅｋ　Ｒ．Ａ．Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ：ｔｏｗａｒｄ　ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ　ｔｈｅ　ｆｕｎｃ—　ｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｕｇａｒｓ［Ｊ］．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．，１９９６，９６：６８３．　［４］Ｐｕｄｌａｋ　ＫＡ．Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ　ｍｏｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ｓｅｒｕｎｌ　ｇｌｏｂｕｌｉｎ　ａｆｔｅｒ　ｓｔｏｒｅ［Ｊ］．Ａｒｃｈ　Ｐａｔｈｏｌ　Ｌａｂ　Ｍｅｄ，１９８９，１１３　（７）：８０８．　［５］韦丽华，王金祥，支国华，等．血清贮存时间对蛋白　电泳结果影响的探讨［Ｊ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