电针促进MPTP帕金森模型小鼠黑质致密部nestin表达的研究

JournalofChengduUniversityofTCM

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实验研究

电针促进MPTP帕金森模型小鼠黑质致

密部nestin表达的研究

尹海燕　唐勇　陈瑾　余曙光

(成都中医药大学,针灸推拿学院,四川成都　610075)

　　摘　要:目的:观察比较12甲基24苯基21,2,3,6四氢吡啶(MPTP)诱导的帕金森小鼠模型及其接

受电针治疗后黑质致密部nestin的表达变化。方法:以腹腔注射(30mg/kg)MPTP诱导形成帕金森小鼠模型,电针“合谷”、“太冲”穴,频率2～100HZ,电压2～4V,疏密波,每日1次,每次20min,7次为1疗程,共治疗3个疗程。分别在7d造模后、3个疗程治疗结束,采用免疫组化检测黑质致密部nestin表达。结果:在7d造模后,模型组nestin阳性细胞计数和积分光密度较空白组、NS组多(P<0105);3个疗程治疗结束,空电组nestin阳性细胞计数和积分光密度较空白组多(P<0105);模型组较空白组多(P<0101);电针组较模型组多(P<0101)。结论:MPTP可促进帕金森模型小鼠黑质致密部nestin表达;电针

不仅可促进生理条件下黑质致密部nestin表达,也可促进帕金森病病理条件下nestin表达。

关键词:帕金森病;黑质致密部nestin;针灸疗法中图分类号:R24513;R58　　文献标识码:A　　文章编号:100420668(2008)0220021204　　针灸对帕金森(Parkinsonπsdisease,PD)的临

[1]

床和机理研究正在逐步深入,本实验以黑质致密部nestin的表达为切入点,以公认的MPTP诱导PD小鼠模型为对象,开展针刺作用机制研究,为进一步丰富针灸治疗PD作用原理提供实验依据。1　材料与方法111　动物选择

C57BL/6J小鼠90只,雄性,6～7周龄,体重(18±2)g,由成都中医药大学实验动物中心提供。动物在实验前适应性驯养1w,动物房温度和湿度分别维持在20℃和70%左右。112　主要试剂

1-甲基-4苯基-1,2,3,6四氢吡啶(1-methyl,4-phenyl-1,2,3,6tetrahydropyridine,MPTP)100mg:sigma公司提供;Nestin免疫组化试剂一抗、相应二抗购自博士德生物工程有限公司。113　主要仪器

电针仪:G6805-I型治疗仪,青岛鑫生实业有

限公司;针灸针:环球牌无菌针灸针,苏州环球针灸医疗器械有限公司;BX50光学显微镜:日本O2LYMPUS公司;BIOMIAS图像分析系统:四川大学图像图形研究所。114　动物分组

首先将经过行为学筛选后符合标准的42只动物分为造模7d和21d两个时间点:造模7d时间点包括空白组、生理盐水组(简称NS组)和模型组;造模后21d时间点包括空白组、空白电针组(简称空电组)、模型组、模型+电针组(简称电针组),每组6只。115　动物处理

空白组:不造模,不施针。

NS组:小鼠腹腔注射019%NS,30mg/kg,每天1次,连续7天。

模型组:小鼠腹腔注射MPTP,30mg/kg,每天1次,连续7天。7天后停止注射并处死其中6只,剩余6只继续喂养至造模后21d。

基金项目:国家中医药管理局课题资助(国中医药科02-03JP41)

作者简介:尹海燕,女,1979年生,医学硕士;研究方向:老年疾病针灸作用机理。

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成都中医药大学学报2008年第31卷

电针组:小鼠腹腔注射MPTP30mg/kg,7d后开始针灸治疗。穴位选取“四关”穴:“合谷”、“太冲”,穴位定位根据《实验针灸学》和《中国兽医针灸学》定位标准进行。双侧交替进行,电针频率2～100HZ,电压2～4V,疏密波,每日1次,每次20min,7次为1疗程,共治疗3个疗程。疗程间休息1d。

空电组:小鼠不造模,开始实验7d后,与电针组同时、同样的针刺方法给予针刺。116　指标检测11611　取材

见表1及图1～图3。

表1　造模7d后黑质致密部nestin染色结果(x󰁡±s)

组别n阳性细胞计数(个)积分光密度空白组66100±214625628178±2532163NS组67118±310225085199±20831

3△

模型组611133±214333268154±44331163△　　与空白组比较,3P<0105;与NS组比较,(P<0105)

动物于造模后7d和3个疗程治疗结束后,腹

腔注射1%戊巴比妥钠30mg/kg,给予4%多聚甲醛心脏灌注后,剥脑,按照小鼠脑图谱取出黑质致密部,4%多聚甲醛固定,作nestin免疫组化检测。11612　免疫组化ABC法检测步骤

按照试剂盒说明操作进行。免疫组化:常规石蜡包埋、石蜡切片厚6～8μm,脱蜡到水后进行免疫组化ABC染色;3%H2O2室温孵育5～10min,灭活内源性过氧化物酶;蒸馏水洗涤5min×3次;微波修复抗原:将切片放入0101M枸橼酸盐缓冲液(PH610),加热至沸腾后断电,间隔5～10min,反复2次。自然冷却后PBS洗涤2次;滴加抗原修复液I进一步暴露抗原,每张切片滴加20μL,室温5～10min;PBS洗涤5min×3次;滴加正常山羊血清封闭

)图1　空白组造模7dnestin免疫组化染色(200×

)图2　NS组造模7dnestin免疫组化染色(200×

液,每张切片滴加20μL,室温20min,甩去多余液体,不洗;滴加1∶100稀释的一抗,每张切片滴加20μL,37℃孵育1h左右;PBS洗涤,2min×3次;滴加生物素化山羊抗小鼠IgG,每张切片滴加20μL,20℃～37℃20min;PBS洗涤,2min×3次;滴加试剂SABC,每张切片滴加20μL,20℃～37℃20min;PBS洗涤,5min×4次;DAB显色:镜下控制显色时间5～30min;洗涤、复染、脱水、透明、封片。阴性对照除用PBS代替一抗外,其它步骤相同。11613　结果观察

阳性细胞细胞膜/胞浆染成棕色或棕黄色。在400×视野下选取5个视野先进行阳性细胞计数,然后以计算机图像分析系统选取10个视野进行染色结果的积分光密度分析。11614　统计学处理

所有结果以均数±标准差(x󰁡±s)表示。采用SPSS1110统计软件包进行单因素方差分析、两两比较(Q检验)。2　结　果211　造模7d后黑质致密部nestin免疫组化染色结果

)图3　模型组NS组造模7dnestin免疫组化染色(200×

表1显示,NS组和空白组nestin染色阳性细胞

数目、积分光密度的差异均无统计学意义(P>0105);模型组和空白组、NS组比较,nestin染色阳性细胞数目、积分光密度差异均有统计学意义(P<0105)。212　治疗3个疗程后黑质致密部nestin免疫组化染色结果

见表2及图4～图7。

表2　3个疗程治疗结束后各组小鼠黑质致密部

nestin染色结果(x󰁡±s)

组别

空白组空电组模型组电针组

n

6666

阳性细胞计数(个)

6133±2101

15138±4173332118±715433△△53117±810433△△◇◇

积分光密度

29183193±198312142177190±17151683384360122±386116033△△140848179±280618533△△◇◇

　　与空白组比较,3P<0105,33P<0101;与空电组比较,△P<0101;与模型组比较,◇◇P<0101第2期尹海燕等　电针促进MPTP帕金森模型小鼠黑质致密部nestin表达的研究　

[2]

・23・

)图4　空白组3个疗程治疗结束nestin免疫组化染色(200×

研究认为,黑质部位存在NSC,但该结果没有得

[3]

到重复性证实;我们的实验结果提示,不仅正常小鼠黑质致密部有nestin阳性表达,接受MPTP注射及电针刺激后nestin表达增强。这一结果与王彦春在帕金森大鼠模型黑质部位nestin免疫组化检测

[4]

结果类似。这似乎可支持黑质NSC的存在,但缺点是缺乏更多的NSC标记物检测支持,因此下一步应增加NSC标记物检测以提供更多的证据支持。

在大鼠脊髓损伤、脑梗死、帕金森病模型的研究中发现,针刺可促进脊髓、海马、皮质、梗死灶

[428]

边缘、黑质、纹状体等部位的nestin表达。综合本实验的结果,我们可以初步认为,针刺促进nestin表达可能是一较为肯定的现象,针刺可能是诱导内源性NSC增殖的可行性手段。我们的实验结果还显示,在生理条件下,NSC处于静息状态,接受MPTP药物刺激和电针刺激后,nestin表达增强,说明无论是外源性的药物刺激还是电针刺激都可能促使NSC由静息转为激活状态;在病理状态下,当MPTP注射停止,形成PD模型21d后,黑质致密部nestin表达仍是进一步增强,这表明虽然MPTP药物刺激停止,但由于MPTP注射诱导帕金森疾病模型的形成,随之而来的多巴胺神经元变性等病理刺激可能成为新一轮刺激因素,促使nestin表达持续增强,这一增强应是机体自身代偿恢复的有利因素,因为促进NSC的增殖分化是神经变性疾病治疗新的策略和希望。同时,我们的前期研究表明,与本实验相同的电针治疗方案可促进黑质致密部脑源性神经营养因子(brainderivedneurotrophicfactor,BDNF)、神经细胞黏附分子(neuralcelladhesionmolecule,NCAM)的表达,促进突触可塑性的发挥。现有的研

[13][14]

究表明,BDNF、NCAM是促进NSC增殖分化的重要因素;NSC的激活,新的神经元的发生,是

[15]

突触可塑性发挥的有利条件;综合考虑可初步认为,电针—BDNF、NCAM-NSC—突触可塑性这一级联反应和过程是针灸促进帕金森神经康复的重要环节,但需要进一步的深入研究证实。

参考文献

[1]唐勇,陈瑾1针灸治疗帕金森病的临床及实验:5年研

[10211]

[12]

[9]

)图5　空电组3个疗程治疗结束nestin免疫组化染色(200×

)图6　模型组3个疗程治疗结束nestin免疫组化染色(200×

)图7　电针组3个疗程治疗结束nestin免疫组化染色(200×

表2显示,3个疗程结束后,空电组、模型组、电针组nestin阳性细胞数目及积分光密度均较空白

组多,差异具有统计学意义(P<0105,P<0101);模型组、电针组nestin阳性细胞数目及积

分光密度均较空电组多,差异具有统计学意义(P<0101);电针组与模型组比较,差异也具有统计学意义(P<0101)。3　讨论

Nestin又称为神经上皮干细胞蛋白巢蛋白,常

究进展[J]1中国临床康复,2004,8(34):77592611

[2]ZhaoM,MommaS,DelfaniK,etal1Evidenceforneuro2

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[3]FrielingsdorfH,SchwarzK,BrundinP,etal,Noevidence

fornewdopaminergicneuronsintheadultmammaliansub2stantianigra[J]1PNAS,2004,101(27):101772821

(下转第26页)　　

作为神经干细胞(Neuralstemcell,NSC)的鉴定标志,属于中间丝蛋白家族,只在多潜能的神经外胚层细胞表达,随着神经上皮的分化成熟逐渐消失。关于黑质部位是否存在NSC尚存争议。Zhao

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表4　DSS对肝组织TC、TG的影响(x󰁡±s)组别假手术组模型组

DSS低剂量组DSS高剂量组

n

成都中医药大学学报2008年第31卷

hTC(mmol/g)0131±010930181±01100143±010630146±011430152±01273

3

3333

hTG(mmol/g)0131±010530166±01100149±011230136±010630153±01093

33△33

10991010

血脂康组

　　与模型组比较　3P<0105　3△P<0105P<0101;与血脂康组比较　

3　讨论

中医学虽无血脂称谓,但历代文献有关脂膏化

生、转运、输布的论述甚丰。血脂异常可归属于中医“痰浊”、“瘀血”范畴,近年来已被众多学者所认同。其中肝脾失调,痰浊瘀血阻滞是本病的重要病机之一。脾为后天之本,主运化,为津液输布之枢,脾气健,水谷肥甘之物化为精微以营周身,反之则津液不得正常运行吸收,脂膏不得布散则沉积集聚,变生痰湿脂浊,注入血中而致脂膏过剩。肝主疏泄促使气血津液畅达宣泄,肝失条达则气机不畅,津血运行障碍,留而为痰为瘀。再者肝主疏泄有助于脾胃升清降浊的协调并使胆汁正常分泌排泄。若肝失疏泄,木不疏土,则脾失健运致水谷精微不从正化,津液转输异常形成痰浊。DSS为妇人良方,虽原著为“妇人腹中诸疾痛”、“妇人怀妊,腹中绞痛”而设,但据其病机肝脾失调、水湿瘀血阻滞,课题组临床用治血脂异常而收佳效。方中当归、川芎、芍药入血分补血养肝、活血化瘀;茯苓、白术、泽泻三药走水分健脾

渗湿、化痰除饮,六药合用补中有通,安中有利,血水并治共奏祛痰湿、化瘀血、调养肝脾之功。

流行病学调查和临床实验报告表明,绝经后女性心脑血管疾病发病率明显高于绝经前。其发病率的年龄变化特征反映了心脑血管疾病与雌激素的水平变化密切相关。女性绝经后卵巢功能衰退,内分泌系统发生明显变化,雌激素水平显著降低,血清中TC、TG升高,HDL合成减少,LDL合成增多,这种脂代谢的变化正是更年期妇女发生心脑血管疾病的主要危险因素。本实验通过摘除雌性大鼠双侧卵巢而不附加其他处理,获得血脂异常动物模型。结果显示:DSS能明显降低TC、LDL-C、ApoB100水平,升高HDL-C、ApoAI水平,表明DSS对绝经后女性雌激素水平下降所导致的血脂异常有较好的调节作用。现代药理研究表明DSS可能为一激素复活剂,通过脑内植物神经系统调整垂体-卵巢轴的内分泌激素水平,改善卵巢功能,促进黄体激素释放,增加雌二醇及孕酮的含量,从而使体内雌激素水平升高。DSS用治多种妇科疾患,与现代研究发现其有影响雌激素水平的作用似有相通之处,对此有待于进一步研究。

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　　(上接第23页)

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