分子生物学方法在环境微生物生态学中的应用研究进展_姬洪飞

网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.2031.Q.20160413.1055.010.html

第３６卷第２４期２０１６年１２月

ＡＣＴＡＥＣＯＬＯＧＩＣＡＳＩＮＩＣＡ

生态学报

Ｖｏｌ．３６，Ｎｏ．２４Ｄｅｃ．，２０１６

ＤＯＩ：１０．５８４６／ｓｔｘｂ２０１５０６０４１１３２

姬洪飞，王颖．分子生物学方法在环境微生物生态学中的应用研究进展．生态学报，２０１６，３６（２４）：　⁃　．

ＪｉＨＦ，ＷａｎｇＹ．Ａｄｖａｎｃｅｓｉｎｍｏｌｅｃｕｌａｒａｐｐｒｏａｃｈａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｉｎｍｉｃｒｏｂｉａｌｅｃｏｌｏｇｙｓｔｕｄｉｅｓ．ＡｃｔａＥｃｏｌｏｇｉｃａＳｉｎｉｃａ，２０１６，３６（２４）：　⁃　．

分子生物学方法在环境微生物生态学中的应用研究进展

姬洪飞１，２，王　颖１，２，∗

１西北农林科技大学水土保持研究所黄土高原土壤侵蚀与旱地农业国家重点实验室，杨凌　７１２１００２中科院水利部水土保持研究所，杨凌　７１２１００

摘要：随着分子生物学方法的不断发展和改进，微生物在生态系统中的作用被更好的挖掘出来。目前快速发展的先进的分子生物学技术，已经开始应用于分析环境微生物的多样性、微生物的生物地理学及微生物对气候变化的响应等。一般环境微生物的研究目标主要有３个，即确定微生物的种类和多样性、微生物的功能或潜在作用及在特定时间点活跃的微生物等。然而，现有微生物的研究方法复杂多样，容易给研究者在方法的选择上带来困惑。本文将从微生物的多样性和功能研究两个方面介绍和分析相应的分子生物学方法，尤其是近年来快速发展的高通量测序、宏组学和单细胞水平研究方法（如纳米二次离子质谱与荧光原位杂交相结合的方法）等新技术及其应用情况，以期为研究者选择合适的研究方法进行环境微生物的研究提供依据。关键词：微生物多样性；微生物功能；同位素标记；高通量测序；宏基因组／宏转录组；单细胞水平研究方法Ａｄｖａｎｃｅｓｉｎｍｏｌｅｃｕｌａｒａｐｐｒｏａｃｈａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｉｎｍｉｃｒｏｂｉａｌｅｃｏｌｏｇｙｓｔｕｄｉｅｓ

１ＳｔａｔｅＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＳｏｉｌＥｒｏｓｉｏｎａｎｄＤｒｙｌａｎｄＦａｒｍｉｎｇｏｎＬｏｅｓｓＰｌａｔｅａｕ，ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＳｏｉｌａｎｄＷａｔｅｒＣｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ，ＮｏｒｔｈｗｅｓｔＡ＆ＦＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｙａｎｇｌｉｎｇ２ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＳｏｉｌａｎｄＷａｔｅｒＣｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ，ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓａｎｄＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＷａｔｅｒＲｅｓｏｕｒｃｅｓ，Ｙａｎｇｌｉｎｇ７１２１００，Ｃｈｉｎａ７１２１００Ｃｈｉｎａ

ＪＩＨｏｎｇｆｅｉ１，２，ＷＡＮＧＹｉｎｇ１，２，∗

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓｉｎｈａｂｉｔａｌｍｏｓｔｅｖｅｒｙｉｍａｇｉｎａｂｌｅｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｎｄａｒｅｉｍｐｏｒｔａｎｔｐｌａｙｅｒｓｉｎｂｉｏｇｅｏｃｈｅｍｉｃａｌｃｙｃｌｅｓ．Ｗｉｔｈｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｏｆｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｙ⁃ｂａｓｅｄａｐｐｒｏａｃｈｅｓ，ｔｈｅｆｕｎｃｔｉｏｎｓａｎｄｃｏｍｍｕｎｉｔｙｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｏｆｂｅｅｎａｐｐｌｉｅｄｔｏｑｕｅｓｔｉｏｎｓｒｅｇａｒｄｉｎｇｍｉｃｒｏｂｉａｌｄｉｖｅｒｓｉｔｙ，ｂｉｏｇｅｏｇｒａｐｈｙ，ａｎｄｒｅｓｐｏｎｓｅｓｔｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｃｈａｎｇｅｓ．Ｓｔｕｄｉｅｓｏｆｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓｉｎｔｈｅｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｇｅｎｅｒａｌｌｙｆｏｃｕｓｏｎｔｈｒｅｅｏｂｊｅｃｔｉｖｅｓ—ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇｗｈｉｃｈｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓａｒｅｐｒｅｓｅｎｔ，ｗｈａｔｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓｉｎｅｃｏｓｙｓｔｅｍｓｃａｎｂｅｅｘｐｌｏｒｅｄｉｎｍｏｒｅｄｅｔａｉｌｔｈａｎｅｖｅｒｂｅｆｏｒｅ．Ｒａｐｉｄｌｙａｄｖａｎｃｉｎｇｍｏｌｅｃｕｌａｒｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓｈａｖｅ

ｔｈｅｉｒｆｕｎｃｔｉｏｎｓａｒｅ，ａｎｄｗｈｉｃｈａｒｅａｃｔｉｖｅａｔａｇｉｖｅｎｔｉｍｅ．Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｄｉｎｇｔｈｅｒａｎｇｅｏｆｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓｃｕｒｒｅｎｔｌｙａｖａｉｌａｂｌｅｃａｎｂｅｄａｕｎｔｉｎｇ．Ｔｏｆａｃｉｌｉｔａｔｅｔｈｅｓｅｌｅｃｔｉｏｎｏｆｔｈｅａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅａｐｐｒｏａｃｈｂｙｒｅｓｅａｒｃｈｅｒｓｔｏｓｔｕｄｙｍｉｃｒｏｂｉａｌｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓｉｎｔｈｅｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ，ｗｅｉｎｔｒｏｄｕｃｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｍｅｔｈｏｄｓａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｍｉｃｒｏｂｉａｌｄｉｖｅｒｓｉｔｙａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎ，ｓｕｃｈａｓｔｈｅｒａｐｉｄｌｙｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ⁃ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｉｎｓｉｔｕｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ＮａｎｏＳＩＭＳ⁃ＦＩＳＨ），ａｎｄｔｈｅｉｒａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｉｎｍｉｃｒｏｂｉａｌｅｃｏｌｏｇｙｓｔｕｄｉｅｓ．ｈｉｇｈ⁃ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ｍｅｔａ⁃ｏｍｉｃｓ，ａｎｄｍｉｃｒｏｂｉａｌｓｉｎｇｌｅ⁃ｃｅｌｌａｐｐｒｏａｃｈｅｓ（ｅ．ｇ．，ｎａｎｏ⁃ｓｃａｌｅｓｅｃｏｎｄａｒｙｉｏｎｍａｓｓ

ＫｅｙＷｏｒｄｓ：ｍｉｃｒｏｂｉａｌｄｉｖｅｒｓｉｔｙ；ｍｉｃｒｏｂｉａｌｆｕｎｃｔｉｏｎ；ｉｓｏｔｏｐｅｌａｂｅｌｉｎｇ；ｈｉｇｈ⁃ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ；ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃｓ／ｍｅｔａｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｉｃｓ；ｓｉｎｇｌｅ⁃ｃｅｌｌａｐｐｒｏａｃｈｅｓ

基金项目：国家自然科学基金项目（４１３０１３２２）；黄土高原土壤侵蚀与旱地农业国家重点实验室基金项目（Ｋ３１８００９９０２⁃１３０３）；陕西省自然科学基金（２０１５ＪＱ４１１１）

收稿日期：２０１５⁃０６⁃０４；　　网络出版日期：２０１５⁃００⁃００∗通讯作者Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ．Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｙｉｎｇｗａｎｇ＠ｎｗｓｕａｆ．ｅｄｕ．ｃｎ

ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｃｏｌｏｇｉｃａ．ｃｎ

２　生　态　学　报　　　３６卷　

微生物包括细菌、古菌、真菌等，是生态系统的重要组成部分，几乎存在于所有已知的环境中，在生态系统中起着非常重要的作用，如维持生态系统功能、直接参与碳、氮、硫、磷和一些金属的生物地球化学循环［１］、加快污染环境修复进程等［２］。此外，微生物在生态系统对气候变化的响应方面也可能起着重要作用［３］。基于渐浓。

目前环境微生物生态学的研究主要集中在确定所研究的环境中有哪些微生物存在和分析微生物在所研究的环境中起什么样的作用或执行哪个生态功能［４］两个方面，此外，微生物之间以及微生物与环境因子之间的相互作用受到越来越多的关注。由于微生物个体小（平均直径约１μｍ），肉眼不可见且未知，微生物的研究方法的发展加速了研究者对微生物的认知。在过去的十多年中，微生物的研究方法得到了快速发展，且商业化迅速，特别是高通量测序、宏组学和单细胞水平研究方法（如纳米二次离子质谱与荧光原位杂交相结合的方法）等（图１）技术手段使微生物研究的难度和成本都得到了显著改善。随着研究方法的发展，微生物在生态系统中的作用可以被更好的挖掘出来。然而，快速发展的微生物研究方法，以及之前已有的研究方法，给不熟悉这些技术的研究者在方法的选择上带来了困惑。因此，本文将从微生物的多样性和功能分析两个方面对相应的研究方法进行阐述，并以１—２篇文献为例具体介绍相关方法在微生物生态学研究中的应用，以期为研究者选择合适的研究方法进行环境微生物的研究提供参考。１　环境微生物的多样性分析

在很多微生物生态学的研究中，首先是分析所研究的环境中有哪些微生物，以及微生物的多样性和分布情况。微生物研究的传统方法首先是获取环境样品，然后对其进行分离培养得到微生物的单菌株。然而，很多微生物难以通过现有的培养方法得到［５］，使微生物的多样性分析受到很大。与传统分离培养方法不同，现代分子生物学技术直接以从环境样品中提取的核酸（ＤＮＡ和ＲＮＡ）为分析对象，以特定的核酸片段为生物标志物，理解该环境中微生物的组成和多样性，即将所提取的ＤＮＡ进行目标片段的ＰＣＲ扩增，得到的ＰＣＲ产物通过多种技术来鉴定其组成的多态性，如群落结构分析的指纹图谱、微列阵（Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ）和高通量测序等。微生物多样性分析的研究中，ＰＣＲ扩增的目标片段可以选择微生物的一段相对保守而又足以区分不同类群的基因区域，如细菌和古菌常用的１６ＳｒＲＮＡ［６］、真菌的１８ＳｒＲＮＡ或ＩＴＳ区［７］等；同时，一些微生物的功能基因也可用于分析功能微生物的多样性，如氨氧化细菌的氨单加氧酶ａｍｏＡ基因（氨单加氧酶，催化硝化作用的第一步）。得到目标基因的ＰＣＲ产物后，可根据需求选择下面的方法进行微生物的多样性分析１．１　变性梯度凝胶电泳和末端性片段长度多态性变性梯度凝胶电泳（ＤＧＧＥ）和末端性片段长度多态性（Ｔ⁃ＲＦＬＰ）均是通过电泳对ＰＣＲ产物进行分型，从而分析微生物的多样性和相对丰富度，在分析环境中优势微生物群落（相对丰富度＞１％的微生物种群）［８］的变化方面具有较多的应用（表１）。ＤＧＧＥ和Ｔ⁃ＲＦＬＰ是应用于环境微生物多样性分析中较早的分子生物学方法，不仅应用方便，分辨率高，且价格低廉。ＤＧＧＥ主要用于分析低于５００ｂｐ的片段；Ｔ⁃ＲＦＬＰ对低于５００ｂｐ的酶切片段分型精度较高，而高于５００ｂｐ的酶切片段分型精度则不足。ＤＧＧＥ条带可通过切胶回收、构建克隆文库和测序来了解感兴趣的条带的系统发育信息或物种信息，而对于复杂的微生物群落组成（如土壤细菌的群落组成）的分析，Ｔ⁃ＲＦＬＰ的分辨率高于ＤＧＧＥ。１．２　微列阵（Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ）

基因微列阵用来分析样品中微生物的组成和多样性，已经用了将近２０年，经历了数代的改进，常用的微列阵有系统发育芯片（ＰｈｙｌｏＣｈｉｐｓ，用于识别微生物以及微生物之间的系统发育联系，分析微生物的多样性）和功能基因芯片（ＧｅｏＣｈｉｐｓ，用于研究功能基因的多样性和功能微生物的活性）。微列阵即为排满探针（用于和样品ＤＮＡ进行杂交的已知短序列）的芯片，通过探针提供生物的系统发育信息或功能性质信息、或者二者

ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｃｏｌｏｇｉｃａ．ｃｎ

（图１）。

微生物在生态系统中所发挥的重要作用，环境和生态学研究的学者对理解生态系统中微生物的动态变化兴趣

　２４期　　　姬洪飞　等：分子生物学方法在环境微生物生态学中的应用研究进展　３

图１　微生物生态学研究中分子生物学方法的应用选择图［４］

Ｆｉｇ．１　Ｄｅｃｉｓｉｏｎｄｉａｇｒａｍｆｏｒｃｈｏｏｓｉｎｇａｍｏｌｅｃｕｌａｒａｐｐｒｏａｃｈｆｏｒｕｓｅｉｎｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙｓｔｕｄｉｅｓ

均包含。当样品中的序列（纯菌、环境样品ＤＮＡ或ＲＮＡ的目标片段的荧光标记ＰＣＲ产物或随机引物的荧光标记ＰＣＲ产物）与探针进行杂交后，即可计算与探针匹配序列的相对荧光比例，从而获得微生物的多样性和相对丰富度信息。

基因微列阵的方法尤其适合识别不同时间、地点和处理之间的代表微生物或微生物群落的差别，此外，功能基因芯片还可以定量Ｃ、Ｎ、Ｓ和Ｐ循环、有机污染物降解和胁迫响应等相关的功能基因的变化。Ａｒｏｎｓｏｎ等［１９］利用３代ＰｈｙｌｏＣｈｉｐ（１６ＳｒＲＮＡ基因微列阵，可以提供６００００个左右不同ＯＴＵ的信息），研究不同实验条件下松林土壤甲烷循环的相关微生物，分析了土壤中甲烷氧化菌（Ｍｅｔｈａｎｏｔｒｏｐｈｓ）和产甲烷菌（Ｍｅｔｈａｎｏｇｅｎｓ）的多样性及其与土壤中甲烷通量变化之间的联系。该方法不仅检测到了目标群落在不同时间、地点和氮水平处理之间的差异，同时发现了群落中占少数的微生物的变化，而在克隆筛选的方法或深度不够的高通量测序中，这些少数微生物的差异均可能被忽略。Ｃｏｎｇ等［２０］利用ＧｅｏＣｈｉｐ５．０（覆盖了３９３个功能基因家族）分析了

ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｃｏｌｏｇｉｃａ．ｃｎ

４

ｓｅｇａｔｎａｖ点ｄａ缺ｓｉＤｙｄｇｅｏｚｌｙｏｌａｉｂｎｏａｒｓｃ况ｉｍｅ情ｍｌ标ｔｉｆ用ａｔｎ指ｏ应ｅ析ｓｅｐ的ｍｎ分ｙＴ中ｏｒｉ学ｖｎ态ｅ生ｎｉ物ｓｅ生ｈｃ微ａｏ境ｒｐ环ｐａ在ｒａｓ法ｌｕｅ方ｃｅｌ类ｐｙｔ学ｏ种ｅｌ物ｍｆ品ｐ生ｏｓ样ｍａＳ子ｎｏ分ｉｔｄａｅｃｓ　ｉｕ１ｌｐ表ｐＡｎｏｉ　ｓｔ１ｅ术ｅａｕｎｉｌｂ技ｑｂｉａＴ用ｎｍｈｏｃｃ联ｅＴｎｉｎｏ率ｉｔｕ辨ｌｏｓ分ｅＲ法方ｄ用ｏｈｔ应ｅＭ生　态　学　报　　　

３６卷　

兴⁃Ｔ，在要但偏次测；］由已得量高要镜好发采卤改胞感；种，］需多在３１完，［与获求是需微更自过用来细对９物ＰＬ［，列的］的序差成列列难需不，来的通采］７１物，个Ｆ０序来种证一Ｒ⁃１Ｔ［条带基测偏组，序序很）显记Ｓｍ合品可物验表，移万火碱ａｎ生短条的，或［）生结样，］６微等个来代估飘百退一ｉｍ产更整到时标μ子ＩＭ相Ｈ号１合［一序定低的至段同ｕｌ者得ｌ易得对素Ｓ０电ｏ５ｎ等ＳＩ信止测一的定甚片的Ｉ；容或获，比位ａ—描Ｎ１扫Ｆ号结响］８１不隆不一千中中］２基楚行同；（、法光。信相影［Ｃ］１时］能克段性现几阵１１列［碱使清进谱的４１小）方］荧５光谱会２１［１［可片样多出定测列确序量域个即；不区图移％较ＭＥ镜［的荧质能的带行ＦＲ落会确检及准条定区百难还能确偏ｍ域Ｔ（ｏ微标针强子可离新条进－能来时以不一确列几困能功准谱ｔａ区显目探增也次入程引个要Ｔ群可合结同计果对准序为定功在的光０测镜１微线测盖检掩来二过如一需个物中相以设结，到的多一的潜能到定或Ｈ米备，Ｓ的带每生中做高列有因或功测到检显射锁响ＩＦ纳制成的微程库可的使序难量序因基因到检达且，子Ｘ并影⁃Ｄ与的组Ｅ条过隆阵针可ＧＰ对测很含的基多基列ｎ需术电或，技射）择易Ｒ（品素Ｇ的ＬＦ成泳克列探也４复ＣＧ到的很的序ａｍ高量透ＭＥ选光Ａ针Ｃ探样位；同Ｄ趣Ｒ造电与微是差５４重定得整于知由ａＲ较通与Ｓ（的荧用素善的如化功菌细群的Ｎ微细，９－１微菌氧及化化的因、成真化的跃Ｃ组、境，Ｃ，的能烷以氧氧菌基、氧等活环像２－１功甲菌的菌氨菌中量菌氨烷含等成（Ｎ关和真因细如化境数真烷菌甲的及、包息光像５相１Ｃ环菌、甲基的，信和菌和量能产度应以菌的跃菌氧环菌化质能荧成２１循，成细菌数功和富响细应活能烷或古硝性功测素，Ｎ－的化和及菌丰迫的响中功甲和量落、反组的和检等位Ｎ和跃氧成组以化对胁度菌、落跃迫境落类号菌４活氨落菌氧相和富真菌群活环及菌数群胁度或以化和个群种信解同１ＣＣ、２中如群古烷和环丰、化的、成循和中和富中菌硝成整物的ｎ降和１菌细菌氧等境菌的菌甲、组Ｎ成境环丰境古反组中、、落境生物ａｍ奈素，－，等）物细氨菌环能等细菌落、Ｃ组环循和环菌菌群环微生ａ，Ｒ菌元Ｃ３－１Ｆ生品品品品品品品微养样样样样样样样的培境境境境境境境中体环环环环环环环物水等等等等等等等养体体体体体体体培或水水水水水水水体体、、、、、、、物ＡＡ物Ａ物ＡＡ物Ａ物Ａ水水胞、细积Ｎ物Ｎ或物物Ｒ积Ｒ积ＮＲ积Ｎ物ＮＲ积Ｒ积ＮＲ积ＮＲ沉体积生／／Ａ沉Ａ沉／Ａ沉／／Ａ沉Ａ沉／Ａ沉／Ａ水胞沉微、、、、、、、细、的壤Ｎ、ＮＤ壤Ｄ壤ＮＤ壤ＮＤ壤ＮＤ壤ＮＤ壤ＮＤ菌物菌中土的土的土的土的土的土的土的纯生纯物定定，４，库，，记５４ＨＳ隆记记记记ＩＨ记克标库标标标／序标，标，素隆Ｒ素素素素Ｈ素ｐＣ位克，ｉｈｐ位位位测序位ＳＩ位Ｐ同ＲＣｉ同Ｆ⁃量定ＣＰｏｈ同Ｒ同ａ测ｎｌＣ同ｙｏ定Ｄ同Ｒ定稳量ｈｅ定定ＣＰ定ｉ酸ｍ磷ＰＧ稳稳量稳ｕｌｌＩ焦稳Ａ定Ｃ稳富群丰物对相生（微平平平的平平水水水％平水水胞胞落１水＞）落落落细细群度落群群群单单性Ｐ杂制ＬＦ位限Ｒ⁃ｇ原端Ｔｎ／ｉ末ＥｃＧｎ交光ｅ／Ｇｕ杂荧泳Ｄｑ组ｅ位⁃电性ｓ录ｓｃｉ原谱Ｈｔ胶态ｙａｕｒｐ转ｍ／光质ＳＩ凝多ｒａｏ序ｈｇ宏ｏｓｔｃｐｉｉ荧子Ｆ⁃Ｈ⁃离Ｓ度度ｒｃｉ测ｕ／ｒｏｒ组ｍｃｏｓ谱ＳＩＦ次ＩＭＳ梯长Ｍ量ｈｔ光⁃ｎ二ｏｎａ性段列通⁃因ｎｎｅａｒｈｇ基ｇａｔｔａｔ曼ａｍ米Ｎ变片微高ｉＨ宏ｅＭｅｍ拉ａＲ纳交ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｃｏｌｏｇｉｃａ．ｃｎ

　２４期　　　姬洪飞　等：分子生物学方法在环境微生物生态学中的应用研究进展　５

热带雨林土壤微生物的功能基因的组成和多样性，发现所检测到的基因类型与生物地球化学过程有关，如碳、氮和磷循环相关的功能基因，其中，碳循环相关基因包括易降解和难降解底物的相关微生物基因，在三个取样地点之间显著不同，典范对应分析（ｃａｎｏｎｉｃａｌｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓ）和多元回归树分析（ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅ１．３　高通量测序

ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎｔｒｅｅａｎａｌｙｓｉｓ）均显示土壤有效氮含量与土壤微生物功能基因的组成和代谢潜力显著相关。

Ｓａｎｇｅｒ测序已经用了几十年，测序质量高，序列长度达７５０—１０００ｂｐ。该方法无法测混合序列，需首先建

立克隆文库，即将目标序列转移到寄主细胞（一般为Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）中进行培养，形成单菌株，然后对单菌株中的目标序列进行测序，在分析微生物多样性较高的环境样品时，费时且费用高。

在过去十年中，测序方法得到了很大改进，在Ｓａｎｇｅｒ测序方法的基础上，用不同颜色的荧光标记四种不同的ｄＮＴＰ，当ＤＮＡ聚合酶合成互补链时，每添加一种ｄＮＴＰ就会释放出相应的荧光，捕捉到的荧光信号经过特定的计算机软件处理，从而获得待测ＤＮＡ的序列信息，即边合成边测序，也称为二代测序。该方法以微生物目标基因的ＰＣＲ产物为样本进行测序，一个反应得到几万至几百万条序列，测序的广度和深度大大提高。目前用于环境样品中微生物多样性分析的常用方法有２种，即ＲｏｃｈｅＩｎｃ公司的４５４焦磷酸测序和ＩｌｌｕｍｉｎａＩｎｃ公司的ＭｉＳｅｑ／ＨｉＳｅｑ测序，这两种高通量测序方法通过在每个样品的引物上加标签来识别不同样品的序ＦｌｕｉｄｉｇｍＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＳｏｕｔｈＳａｎＦｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）通过使用阵列芯片，可同时进行２３０４个ＰＣＲ的扩增，将样品定量ＰＣＲ和序列文库ＰＣＲ在一个反应中同时完成，该ＰＣＲ产物可直接用于二代测序分析，仅需５ｈ，与二代测序相结合，可同时得到微生物的群落组成和丰富度信息，简化二代测序样本的制备程序［２１］。目前，很多研究中应用的测序方法依然是４５４焦磷酸测序。然而，Ｒｏｃｈｅ于２０１３年１０月声明４５４焦磷酸测序将在２０１５年底停止运营，但现有的４５４测序仪还将继续运行。与４５４焦磷酸测序相比，Ｉｌｌｕｍｉｎａ平台测序的通量大大提高，序列长度不断改进，费用也有所降低。因此，Ｉｌｌｕｍｉｎａ平台测序以及其他一些测序方法（如Ｈｅｌｉｃｏｎｓ、ＰａｃｉｆｉｃＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ和ＯｘｆｏｒｄＮａｎｏｐｏｒｅＳｙｓｔｅｍ的单分子测序）在今后的环境微生物研究中将会有更多的应用。

二代测序的测序广度和深度较克隆文库的方法大大提高，尤其是提高了对数量上占少数的微生物群落的覆盖，不仅能从群落水平上揭示微生物群落组成的变化，还能从更细的微生物分类水平上显示微生物群落的具体变化，在环境样品的１６ＳｒＲＮＡ、１８ＳｒＲＮＡ、真菌的ＩＴＳ区和功能基因的分析中均有应用［６⁃７，２２⁃２３］。寒带针叶林在全球的占地面积约为１１％，占土壤有机碳储量的１６％，一般认为地上部的植物残体是土壤有机碳累积的主要来源。而Ｃｌｅｍｍｅｎｓｅｎ等［２４］等通过分析北方森林土壤年代序列的有机碳组成发现，５０％—７０％的土壤有机碳储量源于根系和根系伴生微生物，且稳定同位素标记与真菌ＩＴＳ区的４５４焦磷酸测序相结合的研究结果表明，在不同地点之间，有机碳累积差异最大的土壤剖面中，根系伴生真菌均占优势，说明根系伴生真菌在生态系统的碳动态中起重要的调节作用。Ｈｅｒｍａｎｎ⁃ｂａｎｋ［２１］将高通量列阵与二代测序的方法相结合，分析了肠道微生物的丰富度和组成，结果表明，不同肠道位置或腹泻情况下的肠道微生物组成和丰富度不同，腹泻与链球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）成员的数量显著降低相关，尤其是非解乳链球菌（Ｓ．ａｌａｃｔｏｌｙｔｉｃｕｓ）。尽管目前高通量列阵与二代测序相结合的方法的应用较少，该研究依然显示了高通量列阵在定量不同样品中微生物的丰富度的同时，通过与二代测序相结合具有快速得到微生物系统发育信息的潜力。２　环境微生物的功能性质和基因表达分析

除了理解微生物的多样性和群落组成之外，很多时候还需要分析这些微生物成员的功能，如微生物的多样性与其功能性质有什么样的联系，以及微生物与其所在生态系统中的能量和养分流动是如何相互作用的等。微生物功能分析常用的方法包括稳定同位素标记与微生物ＤＮＡ或ＲＮＡ分析相结合的方法、功能基因微列阵（见１．２）、微生物宏基因组和宏转录组分析及单细胞水平研究方法来识别目标微生物的种类和功能的

ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｃｏｌｏｇｉｃａ．ｃｎ

列，均可以同时分析多个环境样品，并得到大量序列。此外，高通量列阵（ＴｈｅＡｃｃｅｓｓＡｒｒａｙ４８．４８，ＡＡ４８．４８，

６　生　态　学　报　　　３６卷　

方法。

２．１　稳定同位素标记与ＤＮＡ或ＲＮＡ相结合

将水体、土壤、沉积物以及其他生态系统中的微生物的种类和功能联系起来一直是微生物生态学研究的主要目标之一。过去二十几年的研究中，环境微生物的种类和功能研究已经得到了大量结果，而二者的直接联系，仍然是个薄弱环节［２５］。稳定同位素和放射性同位素技术将不可培养的微生物种类和代谢功能相联系起来，是微生物生态学发展中的重要进步。稳定同位素探针技术（Ｓｔａｂｌｅｉｓｏｔｏｐｅｐｒｏｂｉｎｇ，ＳＩＰ））采用稳定同位素（如１３Ｃ，１５Ｎ和１８Ｏ等）标记的底物［２６⁃２８］，使利用这些底物的微生物的标志物（ＤＮＡ、ＲＮＡ、蛋白质或磷脂脂肪酸（ＰＬＦＡ））被标记（表２），从而从群落水平识别环境中活跃的微生物以及微生物之间的相互作用。

表２　ＤＮＡ⁃ＳＩＰ、ＲＮＡ⁃ＳＩＰ、ＰＬＦＡ⁃ＳＩＰ和ｐｒｏｔｅｉｎ⁃ＳＩＰ方法方面的比较［２］

Ｔａｂｌｅ２　ＣｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｉｃａｌｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓｆｏｒＤＮＡ⁃ＳＩＰ，ＲＮＡ⁃ＳＩＰ，ＰＬＦＡ⁃ＳＩＰａｎｄｐｒｏｔｅｉｎ⁃ＳＩＰ

性质Ｔｒａｉｔ

敏感性Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ培养时间

Ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎｔｉｍｅ分类学分辨率

Ｔａｘｏｎｏｍｉｃｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ代谢活性预测

Ｉｎｄｉｃａｔｉｏｎｏｆｍｅｔａｂｏｌｉｃａｂｉｌｉｔｙ提取容易程度Ｅａｓｅｏｆｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ稳定性Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ

应用比较Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆ

ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ′ａｐｐｌｉｃａｂｉｌｉｔｙＤＮＡ＜ＲＮＡ＜ＰＬＦＡ＜蛋白质ＤＮＡ＞ＲＮＡ＞ＰＬＦＡ＞蛋白质ＤＮＡ≈ＲＮＡ＞蛋白质＞ＰＬＦＡＤＮＡ＜ＲＮＡ＜蛋白质ＤＮＡ≈ＰＬＦＡ＞ＲＮＡ＞蛋白质ＤＮＡ≈ＰＬＦＡ＞蛋白质＞ＲＮＡ解析

Ｅｘｐｌａｎａｔｉｏｎ

ＤＮＡ⁃ＳＩＰ需要同位素的标记丰度较高，１３Ｃ达到１５—２０％，１５Ｎ达到３０％左右，而蛋白质标记只需１％的标记丰度；ＲＮＡ的标记速度是ＤＮＡ的６．５倍

培养时间与敏感性直接相关，ＤＮＡ⁃ＳＩＰ需要的培养时间最长，也更容易带来微生物交叉取食的偏差ＰＬＦＡ⁃ＳＩＰ只区分较大的分类群，ＤＮＡ或ＲＮＡ⁃ＳＩＰ可提供属水平或者更低水平的分类信息。与１６ＳｒＲＮＡ相比，蛋白序列的数据库现有信息受到很大程度的蛋白质是代谢活性最明确的指示指标，ＤＮＡ只显示代谢潜力

ＤＮＡ和ＰＬＦＡ在不同介质中均可以按照步骤提取获得，而ＲＮＡ和蛋白质在环境样品中的提取有一定困难ＤＮＡ和ＰＬＦＡ相对稳定，蛋白质可能变性，ｍＲＮＡ非常容易降解

唯一可以将微生物种类和代谢功能直接联系起来的方法，还可用于分析植物和微生物之间的相互作用。其中，ＤＮＡ⁃ＳＩＰ和ＲＮＡ⁃ＳＩＰ均可将微生物的系统发育信息或功能基因信息与其代谢过程相联系起来，操作较容易，且分辨率高，在环境样品，尤其是较复杂的环境样品的分析中（如土壤）应用广泛，并常与其他ＤＮＡ或ＲＮＡ分析的方法相结合来分析环境样品中活跃代谢标记底物的微生物群落组成，如荧光实时定量ＰＣＲ、ＤＧＧＥ［２２］、Ｔ⁃ＲＦＬＰ［２３］、微列阵［２９］和高通量测序（目标基因或宏组学）［２２⁃２３，３０］等（表１）。缺氧的水稻土壤微生物对甲烷排放的贡献占全球甲烷排放的１０％—２５％，而甲烷产生的主要碳源是植物残体和根系分泌物，识别活跃代谢植物残体和根系分泌物且产生甲烷的微生物种群具有重要的环境意义。Ｌｕ等［３１］通过采用１３ＣＯ２代替空气中的ＣＯ２对水稻进行脉冲标记，分析根际土壤活跃代谢根系分泌物的微生物，发现根际土壤中古菌ＲｉｃｅＣｌｕｓｔｅｒＩ显著同化了１３Ｃ，说明该类古菌在植物分泌物或残体分解产生甲烷的过程中起着重要的作用。ＤＮＡ）相比，重ＤＮＡ组分（理论上为１３Ｃ⁃ＤＮＡ）中酶切片段为４８５ｂｐ的峰占优势，系统发育上属于硫单胞杆菌属（Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｍｏｎａｓ）；通过宏基因组学的方法，发现该菌除了具有严格厌氧菌的ＩＩ型苯甲酰辅酶Ａ还原酶之外，还具有兼性厌氧菌的Ｉ⁃型苯甲酰辅酶Ａ还原酶，另外，还识别出了各种厌氧电子受体和编码末端氧化酶的相关基因，从而推断出该属微生物代谢甲苯的潜力。２．２　宏基因组学和宏转录组学

微生物基因组和转录组，即提取一种已知生物的ＤＮＡ或ＲＮＡ，不进行目标片段的ＰＣＲ扩增，随机打断成几百个碱基的片段进行测序，得到全面的遗传信息，也称为鸟测序法。与基因组学和转录组学不同的是，宏

ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｃｏｌｏｇｉｃａ．ｃｎ

ＳＩＰ实验虽然只能应用于富集培养物或环境群落的密闭培养实验（ｂｏｔｔｌｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ），但是该方法是目前

Ｋｉｍ等［２３］采用１３Ｃ⁃甲苯标记海洋沉积物中微生物，通过ＤＮＡ⁃Ｔ⁃ＲＦＬＰ分析发现，与轻ＤＮＡ组分（理论上为１２Ｃ⁃

　２４期　　　姬洪飞　等：分子生物学方法在环境微生物生态学中的应用研究进展　７

基因组学和宏转录组学反映的是多种生物或环境中整个群落的特征，包含环境微生物的全部遗传信息，相比于１６ＳｒＲＮＡ，除了群落中各种微生物群落的分类信息外，宏组学更包含了所有微生物的基因信息，有助于对微生物群落的潜在功能进行深入分析［３２］。宏基因组学的挑战有２个方面，一是从随机测序的短序列中识别和定量基因功能，二是将这些功能基因片段与其他可以作为分类信息参考的基因联系起来，一般功能基因主要通过将测得的短序列与已经发表的或已注释的基因组进行比对来识别［４］，与已有的参考数据库信息直接相关。宏转录组学和宏基因组学的区别在于，宏转录组学可以实时反映微生物群落的基因表达情况，得到的信息包括样品中哪些生物在当前是活跃的，以及它们在做什么。微生物细胞和环境样品中（如土壤）ＲＮＡ的滞留时间显著低于ＤＮＡ，因此，环境样品中提取的ＲＮＡ理论上是该样品当前生物基因表达的一个快照。深度宏组学研究常用来理解复杂微生物群落的动态，然而，这类项目（尤其是在土壤中）所需的计算资源依然受到，如计算机硬件和数据处理方面。目前，虽然计算所需硬件的仍然存在，但是数据处理方面发展迅速，如ＷｅｂＣａｒｍａ［３３］，ＭＧ⁃ＲＡＳＴ［３４］，Ｇａｌａｘｙ［３５］和ＧｅｎｅＰａｔｔｅｒｎ［３６］等工具已经得到了广泛的应用。息；与稳定同位素标记相结合，较其他微生物多样性分析的方法，宏组学可以更全面的反应代谢特定底物的微生物的信息。随着测序技术的发展，宏组学的方法在环境微生物的研究中已有较多的应用，包括土壤、湖泊和海洋等生态系统［２３，３０，３７］。Ｘｉａ等［３８］采用宏基因组学和宏转录组学的方法分析了高温下纤维素厌氧降解产生甲烷的过程的微生物群落，结果表明，在纤维素高温降解过程中，热袍菌（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａｌｅｓ）对β⁃糖的消耗是纤维素水解过程中的关键步骤；尽管纤维素发酵过程产生大量的乙酸，嗜乙酸甲烷八叠球菌（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａｌｅｓ）的丰富度较嗜氢甲烷杆菌（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ）低６０％，而关键基因的转录活性结果表明，乙酸降解产甲烷途径的活跃程度显著高于嗜氢产甲烷途径，说明嗜乙酸产甲烷菌在数量上占少数并不代表其代谢活性低。

２．３　单细胞水平研究方法识别目标微生物的种类和功能稳定同位素与微生物的ＤＮＡ或ＲＮＡ（ＤＮＡ／ＲＮＡ⁃ＳＩＰ）相结合，可以从群落水平将微生物的种类、组成与其功能相联系起来，但是对微生物单细胞水平的代谢活性以及不同种类微生物细胞的代谢活性的差异等信息依然难以揭示。随着单细胞成像方法的改进，结合稳定同位素或放射性同位素标记和荧光原位杂交（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｉｎｓｉｔｕｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ＦＩＳＨ），可将微生物的数量、种类和功能以及一些微生物之间的相互作用从视觉上展现在图片中。放射性自显影技术（Ｍｉｃｒｏａｕｔｏｒａｄｉｏｇｒａｐｈｙ，ＭＡＲ）是最早的微生物单细胞活性的测定方法之一，灵敏度高，放射性底物的检测量最低可达１０－１０—１０－１５ｍｇ［３９］，然而，该方法的应用受到标记元素的限Ｒａｍａｎ）和纳米二次离子质谱（Ｎａｎｏ⁃ｓｃａｌｅｓｅｃｏｎｄａｒｙｉｏｎｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，ｎａｎｏＳＩＭＳ）技术的发展，使单细胞成像的方法得到补充。

拉曼光谱技术是根据原子质量高的重同位素（如１３Ｃ和１５Ｎ）产生的拉曼光谱波长较轻同位素短，来分析制，标记元素需要同时具有放射性和合适的半衰期两个条件。拉曼光谱学显微技术（Ｒａｍａｎｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，

宏基因组学和宏转录组学呈现的是多种生物或环境中整个群落的特征，包含环境微生物的全部遗传信微生物细胞的代谢功能。例如，当微生物利用１３Ｃ标记的底物以后，一些生物标志物的拉曼波长变短，如核酸、蛋白质、碳水化合物和脂类等［１４］。此外，尽管每个物种均可以检测到核酸、蛋白质、碳水化合物和脂类等生物标志物，但是不同物种所产生图谱的峰高有一定差异，因此，每个物种产生的拉曼图谱不同，说明拉曼光谱技术还具有生成全细胞指纹图谱（ｗｈｏｌｅ⁃ｏｒｇａｎｉｓｍｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｓ）的潜力［４０］。

纳米二次离子质谱可以检测任何稳定性同位素和具有合适半衰期的任何放射性同位素，常用于分析生物

样品中的Ｃ、Ｎ、Ｐ、Ｓ、Ｏ、Ｈ和卤族元素等［４１］，得到复杂微生物群落中微生物细胞代谢活性的成像。此外，测定同位素的比值信息（例如１３Ｃ／１２Ｃ），可以用于计算单细胞的元素吸收速率，分析元素的代谢途径［２５］，为环境中微生物的单细胞生态学和代谢潜力的研究打开了一个前所未有的窗口。该方法对同位素比值的分析具有非常高的灵敏度和准确度（理论上为１‰）［２５，４２］，与其他单细胞的研究方法相比，具有非常高的优势。另外，纳米二次离子质谱与荧光原位杂交的方法相结合时，探针中的荧光标记由卤素代替，即可在同一张图像中同时

ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｃｏｌｏｇｉｃａ．ｃｎ

８　生　态　学　报　　　３６卷　

显示微生物的种类和功能［１７］，可以避免将荧光原位杂交的图像与ＮａｎｏＳＩＭＳ分析的图像难以正确联系起来的问题。

拉曼光谱技术和纳米二次离子质谱的分辨率可达微米甚至纳米级别，通过放射性或稳定性同位素底物标记分析纯培养或环境微生物细胞的代谢活性，结合原位杂交来确定目标微生物的系统发育信息［４３］，尽管这些方法目前主要应用于相对简单的环境，如水体、纯培养微生物或富集培养物等［４３⁃４４］，在土壤微生物的研究中的应用还需要更多的探索和优化，这些方法的应用增强了对环境微生物种类和功能之间联系的理解，同时为将微生物如动植物一样在单个生物水平上进行研究提供了契机。Ｒａｍａｎ⁃ＦＩＳＨ作为一种单细胞水平非破坏性的方法，在微生物生态学研究中的应用还较少。到目前为止，只有１３Ｃ标记的研究结果。通过１３Ｃ１０⁃萘标记结果表明，地表水中绿脓杆菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐｐ．）可以显著吸收同化１３Ｃ１０⁃萘，且单个绿脓杆菌细胞之间１３Ｃ的含ＮａｎｏＳＩＭＳ⁃ＦＩＳＨ在微生物生态学中的应用较Ｒａｍａｎ⁃ＦＩＳＨ广泛，在微生物碳、氮和硫循环的研究中均有应用［４３，４６⁃４７］。Ｍｕｓａｔ等［４７］研究寡营养湖水中３种厌氧光合细菌，闪囊菌（Ｌａｍｐｒｏｃｙｓｔｉｓｐｕｒｐｕｒｅａ）、奥氏着色菌（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍｏｋｅｎｉｉ）和泥生绿菌（Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍｃｌａｔｈｒａｔｉｆｏｒｍｅ）对无机碳（Ｈ１３ＣＯ⁃３）和氮（１５ＮＨ＋４）的吸收特征，结果表明，仅占细胞总数０．３％的奥氏着色菌贡献了光合细菌碳吸收总量的７０％和氮吸收总量的４０％，说明丰富度较低的奥氏着色菌在该湖水的碳氮循环过程起着主要作用。Ｄｅｋａｓ等［４８］采用１５Ｎ２标记培养实验与ＮａｎｏＳＩＭＳ⁃ＦＩＳＨ分析相结合，发现厌氧甲烷氧化团聚颗粒可以进行生物固氮，且生物固氮由厌氧甲烷氧化古菌完成，此外，部分固定的氮可以转运至与其共生的非固氮的硫还原细菌中，该研究不仅揭示了全球碳、氮和硫循环之间的联系，还显示出将同位素标记技术与ＮａｎｏＳＩＭＳ⁃ＦＩＳＨ联合使用，使微生物细胞的生理组成元素及其相关代谢和转运过程的研究可视化的潜力。３　总结与展望

微生物在全球尺度上着生物地球化学循环过程，影响生态系统的功能。理解生态系统功能，从群落和单细胞水平揭示自然环境中微生物的种类和功能、微生物之间以及微生物与环境因子之间的相互作用是必不可少的。分子生物学方法的发展和进步为环境微生物的研究提供了方便，但是不同方法有其内在的局限性（表１），在方法的选择和应用上需根据研究具体情况进行选择。例如，高通量测序、宏组学和单细胞水平研究的方法均是近些年快速发展的方法，与ＤＧＧＥ和Ｔ⁃ＲＦＬＰ等传统方法相比，微生物的多样性或功能基因的分析的广度、深度和分辨率均有显著提高，显示出了其前所未有的优势和应用前景。然而，这些方法本身仍存在一些问题：（１）高通量测序得到的多为几百个碱基或者更短的序列，组成完整的基因有一定困难；即使获得整条序列，由于很多基因的功能还不清楚，很难获得由序列到功能的准确图谱；（２）单细胞水平研究方法中，Ｒａｍａｎ检测到光谱偏移的同位素标记量需达到１０ａｔｏｍ％［１４］；ＦＩＳＨ样品的自发荧光易影响或掩盖探针的荧光信号；样品的制备过程中，固定和脱水等步骤也可能会影响微生物细胞的同位素组成［１８］等。此外，基于ＰＣＲ的方法，由于引物的选择以及ＰＣＲ本身的问题易对微生物的理解带来偏差，如产生假序列（ｃｈｉｍｅｒａｓ）（可通过生物信息学分析移除，如Ｂｅｌｌｅｒｏｐｈｏｎ［４９］、ＣｈｉｍｅｒａＳｌａｙｅｒ［５０］等软件），另外，得到的信息主要以易于被ＰＣＲ扩增出的优势种群为主，而对环境中丰度较低的稀有微生物种群认识不足。未来的工作中，宏组学和单细胞水平研究的方法将有助于揭示自然环境中微生物整个群落的分类、功能信息以及丰度较低但发挥重要功能作用的微生物种群。由于目前用于阐明微生物群落组成和功能的方法均基于参考数据库，这些参考数据库主要是由克隆、Ｓａｎｇｅｒ测序或基因组等组成，即使新测序技术和单细胞水平技术有巨大的应用潜力，基于培养方法的研究依然要继续，如果没有这些基础数据，不仅很多序列的功能都难以辨认，用于识别环境微生物种类或功能的核酸探针的准确性也受到。随着微生物分子生物学方法（测序技术、单细胞水平研究技术等）的不断改进和数据分析工具的不断发展，对环境中微生物群落组成、微生物之间的相互作用的认识以及对生态系统的功能的理解也在不断增加，为检验和构思生态学理论提供新机遇［４］，也为提出环境修复、自然生态系统和

ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｃｏｌｏｇｉｃａ．ｃｎ

量不同［４５］，说明这种方法除了同时检测微生物的种类和功能外，还具有识别微生物细胞代谢异质性的潜力。

　２４期　　　姬洪飞　等：分子生物学方法在环境微生物生态学中的应用研究进展　９

农业生态系统的可持续管理的新方法奠定基础。

参考文献（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ）：

［１］　ＢａｒｎａｒｄＲ，ＬｅａｄｌｅｙＰＷ，ＨｕｎｇａｔｅＢＡ．Ｇｌｏｂａｌｃｈａｎｇｅ，ｎｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ａｎｄｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ａｒｅｖｉｅｗ．ＧｌｏｂａｌＢｉｏｇｅｏｃｈｅｍｉｃａｌＣｙｃｌｅｓ，２００５，１９［２］　ＵｈｌｉｋＯ，ＬｅｅｗｉｓＭＣ，ＳｔｒｅｊｃｅｋＭ，ＭｕｓｉｌｏｖａＬ，ＭａｃｋｏｖａＭ，ＬｅｉｇｈＭＢ，ＭａｃｅｋＴ．Ｓｔａｂｌｅｉｓｏｔｏｐｅｐｒｏｂｉｎｇｉｎｔｈｅｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃｓｅｒａ：ａｂｒｉｄｇｅ［３］　ＭａｃｋｅｌｐｒａｎｇＲ，ＷａｌｄｒｏｐＭＰ，ＤｅＡｎｇｅｌｉｓＫＭ，ＤａｖｉｄＭＭ，ＣｈａｖａｒｒｉａＫＬ，ＢｌａｚｅｗｉｃｚＳＪ，ＲｕｂｉｎＥＭ，ＪａｎｓｓｏｎＪＫ．Ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃａｎａｌｙｓｉｓｏｆａ［４］　ＺｉｍｍｅｒｍａｎＮ，ＩｚａｒｄＪ，ＫｌａｔｔＣ，ＺｈｏｕＪＺ，ＡｒｏｎｓｏｎＥ．Ｔｈｅｕｎｓｅｅｎｗｏｒｌｄ：ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｍｉｃｒｏｂｉａｌｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒ［５］　ＥｐｓｔｅｉｎＳＳ．Ｔｈｅｐｈｅｎｏｍｅｎｏｎｏｆｍｉｃｒｏｂｉａｌｕｎｃｕｌｔｉｖａｂｉｌｉｔｙ．ＣｕｒｒｅｎｔＯｐｉｎｉｏｎｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２０１３，１６（５）：６３６⁃６４２．

ｅｃｏｌｏｇｉｓｔｓ．ＦｒｏｎｔｉｅｒｓｉｎＥｃｏｌｏｇｙａｎｄｔｈｅＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ，２０１４，１２（４）：２２４⁃２３１．

ｐｅｒｍａｆｒｏｓｔｍｉｃｒｏｂｉａｌｃｏｍｍｕｎｉｔｙｒｅｖｅａｌｓａｒａｐｉｄｒｅｓｐｏｎｓｅｔｏｔｈａｗ．Ｎａｔｕｒｅ，２０１１，４８０（７３７７）：３６８⁃３７１．ｔｏｗａｒｄｓｉｍｐｒｏｖｅｄｂｉｏｒｅｍｅｄｉａｔｉｏｎ．ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＡｄｖａｎｃｅｓ，２０１３，３１（２）：１５４⁃１６５．（１）：ＧＢ１００７．

［６］　ＴｒｉｎｇｅＳＧ，ＨｕｇｅｎｈｏｌｔｚＰ．Ａｒｅｎａｉｓｓａｎｃｅｆｏｒｔｈｅｐｉｏｎｅｅｒｉｎｇ１６ＳｒＲＮＡｇｅｎｅ．ＣｕｒｒｅｎｔＯｐｉｎｉｏｎｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００８，１１（５）：４４２⁃４４６．

ｅｍｅｒｇｉｎｇｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ．ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙＬｅｔｔｅｒｓ，２００９，２９６（１）：９７⁃１０１．ＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌＭｅｔｈｏｄｓ，２００４，５８（２）：１６９⁃１８８．

［７］　ＮｉｌｓｓｏｎＲＨ，ＲｙｂｅｒｇＭ，ＡｂａｒｅｎｋｏｖＫ，ＳｊöｋｖｉｓｔＥ，ＫｒｉｓｔｉａｎｓｓｏｎＥ．ＴｈｅＩＴＳｒｅｇｉｏｎａｓａｔａｒｇｅｔｆｏｒｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｆｕｎｇａｌｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓｕｓｉｎｇ［８］　ＫｉｒｋＪＬ，ＢｅａｕｄｅｔｔｅＬＡ，ＨａｒｔＭ，ＭｏｕｔｏｇｌｉｓＰ，ＫｌｉｒｏｎｏｍｏｓＪＮ，ＬｅｅＨ，ＴｒｅｖｏｒｓＪＴ．Ｍｅｔｈｏｄｓｏｆｓｔｕｄｙｉｎｇｓｏｉｌｍｉｃｒｏｂｉａｌｄｉｖｅｒｓｉｔｙ．Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ［９］　邢德峰，任南琪．应用ＤＧＧＥ研究微生物群落时的常见问题分析．微生物学报，２００６，４６（２）：３３１⁃３３５．［１０］　余素林，吴晓磊，钱易．环境微生物群落分析的Ｔ⁃ＲＦＬＰ技术及其优化措施．应用与环境生物学报，２００６，１２（６）：８６１⁃８６８．

１５９⁃１７５．

［１１］　ＧｅｎｔｒｙＴＪ，ＷｉｃｋｈａｍＧＳ，ＳｃｈａｄｔＣＷ，ＨｅＺ，ＺｈｏｕＪ．Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｉｎｍｉｃｒｏｂｉａｌｅｃｏｌｏｇｙｒｅｓｅａｒｃｈ．ＭｉｃｒｏｂｉａｌＥｃｏｌｏｇｙ，２００６，５２（２）：［１２］　ＬｏｍａｎＮＪ，ＭｉｓｒａＲＶ，ＤａｌｌｍａｎＴＪ，ＣｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｏｕＣ，ＧｈａｒｂｉａＳＥ，ＷａｉｎＪ，ＰａｌｌｅｎＭＪ．Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｂｅｎｃｈｔｏｐｈｉｇｈ⁃ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ［１３］　ＭｉｎｏｃｈｅＡＥ，ＤｏｈｍＪＣ，ＨｉｍｍｅｌｂａｕｅｒＨ．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｇｅｎｏｍｉｃｈｉｇｈ⁃ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｄａｔａｇｅｎｅｒａｔｅｄｏｎＩｌｌｕｍｉｎａＨｉＳｅｑａｎｄＧｅｎｏｍｅ［１４］　ＨｕａｎｇＷＥ，ＳｔｏｅｃｋｅｒＫ，ＧｒｉｆｆｉｔｈｓＲ，ＮｅｗｂｏｌｄＬ，ＤａｉｍｓＨ，ＷｈｉｔｅｌｅｙＡＳ，ＷａｇｎｅｒＭ．Ｒａｍａｎ⁃ＦＩＳＨ：ｃｏｍｂｉｎｉｎｇｓｔａｂｌｅ⁃ｉｓｏｔｏｐｅＲａｍａｎ

１８７８⁃１８８９．

Ａｎａｌｙｚｅｒｓｙｓｔｅｍｓ．ＧｅｎｏｍｅＢｉｏｌｏｇｙ，２０１１，１２：Ｒ１１２⁃Ｒ１１２．ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｐｌａｔｆｏｒｍｓ．ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１２，３０（５）：４３４⁃４３９．ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙａｎｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｉｎｓｉｔｕｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎｆｏｒｔｈｅｓｉｎｇｌｅｃｅｌｌａｎａｌｙｓｉｓｏｆｉｄｅｎｔｉｔｙａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎ．ＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００７，９（８）：

［１５］　Ｐｅｔｔ⁃ＲｉｄｇｅＪ，ＷｅｂｅｒＰＫ．ＮａｎｏＳＩＰ：ＮａｎｏＳＩＭＳａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｆｏｒｍｉｃｒｏｂｉａｌｂｉｏｌｏｇｙ．ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，２０１２，８８１：３７５⁃４０８．

ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ（ＣＡＲＤ⁃ＦＩＳＨ）．ＳｏｉｌＢｉｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００８，４０（７）：１８８３⁃１８９１．ＮａｎｏＳＩＭＳ．ＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００８，１０（３）：５８０⁃５８８．Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，２００４，１５（４）：４７８⁃４８５．

［１６］　ＥｉｃｋｈｏｒｓｔＴ，ＴｉｐｐｋｏｔｔｅｒＲ．Ｉｍｐｒｏｖｅｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｓｏｉｌｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓｕｓｉｎｇｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｉｎｓｉｔｕｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ＦＩＳＨ）ａｎｄｃａｔａｌｙｚｅｄｒｅｐｏｒｔｅｒ［１７］　ＬｉＴＬ，ＷｕＴＤ，ＭａｚéａｓＬ，ＴｏｆｆｉｎＬ，Ｇｕｅｒｑｕｉｎ⁃ＫｅｒｎＪＬ，ＬｅｂｌｏｎＧ，ＢｏｕｃｈｅｚＴ．Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓａｎａｌｙｓｉｓｏｆｍｉｃｒｏｂｉａｌｉｄｅｎｔｉｔｙａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎｕｓｉｎｇ［１８］　ＰｅｔｅｒａｎｄｅｒｌＲ，ＬｅｃｈｅｎｅＣ．Ｍｅａｓｕｒｅｏｆｃａｒｂｏｎａｎｄｎｉｔｒｏｇｅｎｓｔａｂｌｅｉｓｏｔｏｐｅｒａｔｉｏｓｉｎｃｕｌｔｕｒｅｄｃｅｌｌｓ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆｔｈｅＡｍｅｒｉｃａｎＳｏｃｉｅｔｙｆｏｒＭａｓｓ［１９］　ＡｒｏｎｓｏｎＥＬ，ＤｕｂｉｎｓｋｙＥＡ，ＨｅｌｌｉｋｅｒＢＲ．Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｎｉｔｒｏｇｅｎａｄｄｉｔｉｏｎｏｎｓｏｉｌｍｉｃｒｏｂｉａｌｄｉｖｅｒｓｉｔｙａｎｄｍｅｔｈａｎｅｃｙｃｌｉｎｇｃａｐａｃｉｔｙｄｅｐｅｎｄｏｎｄｒａｉｎａｇｅ［２０］　ＣｏｎｇＪ，ＬｉｕＸＤ，ＬｕＨ，ＸｕＨ，ＬｉＹＤ，ＤｅｎｇＹ，ＬｉＤＱ，ＺｈａｎｇＹＧ．Ａｖａｉｌａｂｌｅｎｉｔｒｏｇｅｎｉｓｔｈｅｋｅｙｆａｃｔｏｒｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇｓｏｉｌｍｉｃｒｏｂｉａｌｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ［２１］　Ｈｅｒｍａｎｎ⁃ＢａｎｋＭＬ，ＳｋｏｖｇａａｒｄＫ，ＳｔｏｃｋｍａｒｒＡ，ＬａｒｓｅｎＮ，ＭøｌｂａｋＬ．Ｔｈｅｇｕｔｍｉｃｒｏｂｉｏｔａｓｓａｙ：ａｈｉｇｈ⁃ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔｑＰＣＲａｐｐｒｏａｃｈｃｏｍｂｉｎａｂｌｅｗｉｔｈ［２２］　ＬｕＬ，ＪｉａＺＪ．Ｕｒｅａｓｅｇｅｎｅ⁃ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇＡｒｃｈａｅａｄｏｍｉｎａｔｅａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃａｍｍｏｎｉａｏｘｉｄａｔｉｏｎｉｎｔｗｏａｃｉｄｓｏｉｌｓ．ＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２０１３，１５［２３］　ＫｉｍＳＪ，ＰａｒｋＳＪ，ＣｈａＩＴ，ＭｉｎＤ，ＫｉｍＪＳ，ＣｈｕｎｇＷＨ，ＣｈａｅＪＣ，ＪｅｏｎＣＯ，ＲｈｅｅＳＫ．Ｍｅｔａｂｏｌｉｃｖｅｒｓａｔｉｌｉｔｙｏｆｔｏｌｕｅｎｅ⁃ｄｅｇｒａｄｉｎｇ，ｉｒｏｎ⁃

ｒｅｄｕｃｉｎｇｂａｃｔｅｒｉａｉｎｔｉｄａｌｆｌａｔｓｅｄｉｍｅｎｔ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄｂｙｓｔａｂｌｅｉｓｏｔｏｐｅｐｒｏｂｉｎｇ⁃ｂａｓｅｄｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃａｎａｌｙｓｉｓ．ＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２０１４，１６（１）：１８９⁃２０４．（６）：１７９５⁃１８０９．

ｎｅｘｔｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｔｏｓｔｕｄｙｇｕｔｍｉｃｒｏｂｉａｌｄｉｖｅｒｓｉｔｙ．ＢＭＣＧｅｎｏｍｉｃｓ，２０１３，１４：７８８⁃８０１．ｇｅｎｅｄｉｖｅｒｓｉｔｙｉｎｔｒｏｐｉｃａｌｒａｉｎｆｏｒｅｓｔ．ＢＭＣＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２０１５，１５：１６７⁃１６７．ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｉｎａｐｉｎｅｆｏｒｅｓｔｓｏｉｌ．ＳｏｉｌＢｉｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１３，６２：１１９⁃１２８．

［２４］　ＣｌｅｍｍｅｎｓｅｎＫＥ，ＢａｈｒＡ，ＯｖａｓｋａｉｎｅｎＯ，ＤａｈｌｂｅｒｇＡ，ＥｋｂｌａｄＡ，ＷａｌｌａｎｄｅｒＨ，ＳｔｅｎｌｉｄＪ，ＦｉｎｌａｙＲＤ，ＷａｒｄｌｅＤＡ，ＬｉｎｄａｈｌＢＤ．Ｒｏｏｔｓａｎｄ

ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｆｕｎｇｉｄｒｉｖｅｌｏｎｇ⁃ｔｅｒｍｃａｒｂｏｎｓｅｑｕｅｓｔｒａｔｉｏｎｉｎｂｏｒｅａｌｆｏｒｅｓｔ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１３，３３９（６１２７）：１６１５⁃１６１８．

ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｃｏｌｏｇｉｃａ．ｃｎ

１０　生　态　学　报　　　３６卷　

［２５］　ＫｕｙｐｅｒｓＭＭＭ，ＪøｒｇｅｎｓｅｎＢＢ．Ｔｈｅｆｕｔｕｒｅｏｆｓｉｎｇｌｅ⁃ｃｅｌｌｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．ＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００７，９（１）：６⁃７．

［２６］　ＲａｄａｊｅｗｓｋｉＳ，ＩｎｅｓｏｎＰ，ＰａｒｅｋｈＮＲ，ＭｕｒｒｅｌｌＪＣ．Ｓｔａｂｌｅ⁃ｉｓｏｔｏｐｅｐｒｏｂｉｎｇａｓａｔｏｏｌｉｎｍｉｃｒｏｂｉａｌｅｃｏｌｏｇｙ．Ｎａｔｕｒｅ，２０００，４０３（６７７０）：６４６⁃６４９．［２７］　ＣａｄｉｓｃｈＧ，ＥｓｐａｎａＭ，ＣａｕｓｅｙＲ，ＲｉｃｈｔｅｒＭ，ＳｈａｗＥ，ＭｏｒｇａｎＪＡＷ，ＲａｈｎＣ，ＢｅｎｄｉｎｇＧＤ．Ｔｅｃｈｎｉｃａｌｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓｆｏｒｔｈｅｕｓｅｏｆ

１５

［２８］　ＳｃｈｗａｒｔｚＥ．ＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｇｒｏｗｉｎｇｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓｉｎｓｏｉｌｂｙｓｔａｂｌｅｉｓｏｔｏｐｅｐｒｏｂｉｎｇｗｉｔｈＨ２１８Ｏ．ＡｐｐｌｉｅｄａｎｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，［２９］　ＰｕｔｋｉｎｅｎＡ，ＬａｒｍｏｌａＴ，ＴｕｏｍｉｖｉｒｔａＴ，ＳｉｌｊａｎｅｎＨＭＰ，ＢｏｄｒｏｓｓｙＬ，ＴｕｉｔｔｉｌａＥＳ，ＦｒｉｔｚｅＨ．Ｐｅａｔｌａｎｄｓｕｃｃｅｓｓｉｏｎｉｎｄｕｃｅｓａｓｈｉｆｔｉｎｔｈｅｃｏｍｍｕｎｉｔｙ［３０］　ＤｕｍｏｎｔＭＧ，ＰｏｍｍｅｒｅｎｋｅＢ，ＣａｓｐｅｒＰ．ＵｓｉｎｇｓｔａｂｌｅｉｓｏｔｏｐｅｐｒｏｂｉｎｇｔｏｏｂｔａｉｎａｔａｒｇｅｔｅｄｍｅｔａｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅｏｆａｅｒｏｂｉｃｍｅｔｈａｎｏｔｒｏｐｈｓｉｎｌａｋｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｏｆＳｐｈａｇｎｕｍ⁃ａｓｓｏｃｉａｔｅｄａｃｔｉｖｅｍｅｔｈａｎｏｔｒｏｐｈｓ．ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙＥｃｏｌｏｇｙ，２０１４，８８（３）：５９６⁃６１１．２００７，７３（８）：２５４１⁃２５４６．

ｓｔａｂｌｅ⁃ｉｓｏｔｏｐｅｐｒｏｂｉｎｇｆｏｒｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｍｉｃｒｏｂｉａｌａｃｔｉｖｉｔｙｉｎｓｏｉｌｓ．ＲａｐｉｄＣｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓｉｎＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，２００５，１９（１１）：１４２４⁃１４２８．

Ｎ⁃ＤＮＡ

［３１］　ｓｅｄｉｍｅｎｔ．ＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙＲｅｐｏｒｔｓ，２０１３，５（５）：７５７⁃７６４．

［３２］　Ｌｕ［３３］　刘莉扬ＹＨ，Ｇｅｒｌａｃｈ，Ｗ，崔鸿飞ＣｏｎｒａｄＪüｎｅｍａｎｎ，Ｒ．田埂Ｉｎｓｉｔｕ．Ｓ，高通量测序技术在宏基因组学中的应用ｓｔａｂｌｅｉｓｏｔｏｐｅｐｒｏｂｉｎｇｏｆｍｅｔｈａｎｏｇｅｎｉｃａｒｃｈａｅａ．中国医药生物技术ｉｎｔｈｅｒｉｃｅｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅ．，２０１３，Ｓｃｉｅｎｃｅ，８（３）：１９６⁃２００５，２００．

３０９（５７３７）：１０８８⁃ｕｎａｓｓｅｍｂｌｅｄｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃｒｅａｄｓ．ＴｉｌｌｅＢＭＣＦ，ＧｏｅｓｍａｎｎＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，Ａ，Ｓｔｏｙｅ２００９，Ｊ．ＷｅｂＣＡＲＭＡ：１０：４３０⁃４３０．

ａｗｅｂａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｆｏｒｔｈｅｆｕｎｃｔｉｏｎａｌａｎｄｔａｘｏｎｏｍｉｃｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ［３４］　ＭｅｙｅｒＴｈｅｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃｓＦ，ＰａａｒｍａｎｎＲＡＳＴＤ，Ｄ′Ｓｏｕｚａｓｅｒｖｅｒ⁃ａＭ，ｐｕｂｌｉｃＯｌｓｏｎｒｅｓｏｕｒｃｅＲ，ＧｌａｓｓｆｏｒＥｔｈｅＭ，ａｕｔｏｍａｔｉｃＫｕｂａｌＭ，ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃＰａｃｚｉａｎＴ，ＲｏｄｒｉｇｕｅｚａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎａｌＡ，ＳｔｅｖｅｎｓａｎａｌｙｓｉｓＲ，ｏｆＷｉｌｋｅｍｅｔａｇｅｎｏｍｅｓ．Ａ，ＷｉｌｋｅｎｉｎｇＢＭＣＪ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，

Ｅｄｗａｒｄｓ［３５］　２００８，Ｇｏｅｃｋｓ９：ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌＪ，３８６⁃Ｎｅｋｒｕｔｅｎｋｏ３８６．

ｒｅｓｅａｒｃｈＡ，ｉｎｔｈｅＴａｙｌｏｒｌｉｆｅＪ，ｓｃｉｅｎｃｅｓ．ＴｈｅＧａｌａｘｙＧｅｎｏｍｅＴｅａｍ．Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇａｌａｘｙ：２０１０，ａｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ１１（８）：Ｒ８６⁃Ｒ８６．ａｐｐｒｏａｃｈｆｏｒｓｕｐｐｏｒｔｉｎｇａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ，ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｌｅ，ａｎｄ［３６］　［３７］　ＲｅｉｃｈＦｉｅｒｅｒＭ，Ｎ，ＬｉｅｆｅｌｄＬａｕｂｅｒＴ，ＣＬ，ＧｏｕｌｄＲａｍｉｒｅｚＪ，ＬｅｒｎｅｒＫＳ，Ｊ，ＺａｎｅｖｅｌｄＴａｍａｙｏＪ，Ｐ，ＢｒａｄｆｏｒｄＭｅｓｉｒｏｖＭＪＡ，Ｐ．ＫｎｉｇｈｔＧｅｎｅＰａｔｔｅｒｎＲ．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ２．０．Ｎａｔｕｒｅｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００６，ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ３８（５）：ａｎｄ５００⁃ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ５００．

［３８］　ｓｏｉｌＸｉａｍｉｃｒｏｂｉａｌｒｅｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄＹ，ＷａｎｇｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓＹＢ，ＦａｎｇａｃｒｏｓｓＨＨＰ，ｎｉｔｒｏｇｅｎＪｉｎＴ，ｇｒａｄｉｅｎｔｓ．ＺｈｏｎｇＨＴｈｅＺ，ＩＳＭＥＺｈａｎｇＪｏｕｒｎａｌ，Ｔ．Ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ２０１２，６：ｍｉｃｒｏｂｉａｌ１００７⁃１０１７．ｃｅｌｌｕｌｏｓｅｄｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｎｄｍｅｔｈａｎｏｇｅｎｅｓｉｓ［３９］　ＳｏｒｏｋｉｎＹＩ．ＲａｄｉｏｉｓｏｔｏｐｉｃｂｙｍｅｔａｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｉｃＭｅｔｈｏｄｓｉｎａｎｄＨｙｄｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃＨｅｉｄｅｌｂｅｒｇ：ａｎａｌｙｓｉｓ．ＳｃｉｅｎｃｅＪ，ＷｈｉｔｅｌｅｙＳｐｒｉｎｇｅｒ，Ｒｅｐｏｒｔｓ，ＡＳ．Ｒａｍａｎ１９９９．２０１４，４：６７０８⁃６７０８．

［４０］　２００４，Ｈｕａｎｇ７６（１５）：ＷＥ，Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ４４５２⁃Ｒ４４５８．Ｉ，ＴｈｏｍｐｓｏｎＩＰ，ＢａｉｌｅｙＭｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃａｎａｌｙｓｉｓｏｆｓｉｎｇｌｅｍｉｃｒｏｂｉａｌｃｅｌｌｓ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ［４１］　２００９，ＢｏｘｅｒＳ３８：Ｇ，５３⁃Ｋｒａｆｔ７４．

ＭＬ，ＷｅｂｅｒＰＫ．Ａｄｖａｎｃｅｓｉｎｉｍａｇｉｎｇｓｅｃｏｎｄａｒｙｉｏｎｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙｆｏｒｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓａｍｐｌｅｓ．ＡｎｎｕａｌＲｅｖｉｅｗｏｆ［４２］　ＯｒｐｈａｎｂａｃｔｅｒｉａＶｗｉｔｈｉｎＪ，ＴｕｒｋｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄＫＡ，ＧｒｅｅｎｓｙｎｔｒｏｐｈｉｃＡＭ，ｃｏｎｓｏｒｔｉａＨｏｕｓｅＣｒｅｖｅａｌｅｄＨ．ＰａｔｔｅｒｎｓｂｙＦＩＳＨ⁃ＳＩＭＳ．ｏｆ

１５

Ｎａｓｓｉｍｉｌａｔｉｏｎ［４３］　ＭｕｓａｔＮ，ＦｏｓｔｅｒＲ，ＶａｇｎｅｒＴ，ＡｄａｍＢ，ＫｕｙｐｅｒｓＭＭＭ．ＤｅｔｅｃｔｉｎｇＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌａｎｄｇｒｏｗｔｈｍｅｔａｂｏｌｉｃａｃｔｉｖｉｔｉｅｓＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ｏｆｍｅｔｈａｎｏｔｒｏｐｈｉｃｉｎｓｉｎｇｌｅ２００９，ｃｅｌｌｓ，１１（７）：ＡＮＭＥ⁃２ｗｉｔｈｅｍｐｈａｓｉｓ１７７７⁃ａｒｃｈａｅａ１７９１．

ａｎｄｓｕｌｆａｔｅ⁃ｒｅｄｕｃｉｎｇ

ＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙＲｅｖｉｅｗｓ，２０１２，３６（２）：４８６⁃５１１．ｏｎｎａｎｏＳＩＭＳ．［４４］　Ａｂｒａｈａｍ２０１４，９８（１１）：ＷＲ．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ４８１７⁃４８２８．

ａｎｄｉｍｐａｃｔｓｏｆｓｔａｂｌｅｉｓｏｔｏｐｅｐｒｏｂｉｎｇｆｏｒａｎａｌｙｓｉｓｏｆｍｉｃｒｏｂｉａｌｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．ＡｐｐｌｉｅｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，［４５］　ＨｕａｎｇｗｉｔｈｉｎＷＥ，ＦｅｒｇｕｓｏｎＡ，ＳｉｎｇｅｒＡＣ，ＬａｗｓｏｎＫ，ＴｈｏｍｐｓｏｎＩＰ，ＫａｌｉｎＲＭ，ＬａｒｋｉｎＭＪ，ＢａｉｌｅｙＭＪ，Ｗｈｉｔｅｌｅｙ［４６］　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ．ｍｉｃｒｏｂｉａｌ［４７］　胡行伟Ｍｕｓａｔ，张丽梅Ａｐｐｌｉｅｄｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ：，贺纪正ａｎｄ．Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｉｎｓｉｔｕａｎａｌｙｓｅｓ纳米二次离子质谱技术Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ｕｓｉｎｇｒＲＮＡ（ＮａｎｏＳＩＭＳ）２００９，ａｎｄ７５（１）：ｍＲＮＡｓｔａｂｌｅ在微生物生态学研究中的应用２３４⁃２４１．ｉｓｏｔｏｐｅｐｒｏｂｉｎｇｃｏｕｐｌｅｄｗｉｔｈｓｉｎｇｌｅ⁃ｃｅｌｌＡＳ．Ｒｅｓｏｌｖｉｎｇｒａｍａｎ⁃ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｇｅｎｅｔｉｃ．生态学报，２０１３，３３（２）：ｏｎｔｈｅＮ，ｅｃｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙＨａｌｍＨ，ＷｉｎｔｅｒｈｏｌｌｅｒＢ，ＨｏｐｐｅＰ，ｂａｃｔｅｒｉａ．ＰｅｄｕｚｚｉＳ，ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓＨｉｌｌｉｏｎＦ，ｏｆＨｏｒｒｅａｒｄｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＦ，ＡｍａｎｎＡｃａｄｅｍｙＲ，ＪｏｒｇｅｎｓｅｎｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓＢｏｆＢ，ｔｈｅＫｕｙｐｅｒｓＵｎｉｔｅｄＭＳｔａｔｅｓＭＭ．ｏｆＡ３４８⁃Ａｍｅｒｉｃａ，ｓｉｎｇｌｅ⁃ｃｅｌｌ［４８］　１０５（４６）：ＤｅｋａｓＡＥ，１７８６１⁃Ｐｏｒｅｔｓｋｙ１７８６６．ｏｆａｎａｅｒｏｂｉｃｐｈｏｔｏｔｒｏｐｈｉｃ（５９５１）：４２２⁃４２６．

ＲＳ，ＯｒｐｈａｎＶＪ．Ｄｅｅｐ⁃ｓｅａａｒｃｈａｅａｆｉｘａｎｄｓｈａｒｅｎｉｔｒｏｇｅｎｉｎｍｅｔｈａｎｅ⁃ｃｏｎｓｕｍｉｎｇｍｉｃｒｏｂｉａｌｃｏｎｓｏｒｔｉａ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，［４９］　Ｈｕｂｅｒ２０（１４）：Ｔ，２３１７⁃Ｆａｕｌｋｎｅｒ２３１９．

Ｇ，ＨｕｇｅｎｈｏｌｔｚＰ．Ｂｅｌｌｅｒｏｐｈｏｎ：ａｐｒｏｇｒａｍｔｏｄｅｔｅｃｔｃｈｉｍｅｒｉｃｓｅｑｕｅｎｃｅｓｉｎｍｕｌｔｉｐｌｅｓｅｑｕｅｎｃｅａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，［５０］　ＨａａｓＤｅＳａｎｔｉｓＢＪ，ＧｅｖｅｒｓＤ，ＥａｒｌＡＭ，ＦｅｌｄｇａｒｄｅｎＭ，ＷａｒｄＤＶ，ＧｉａｎｎｏｕｋｏｓＧ，ＣｉｕｌｌａＤ，ＴａｂｂａａＤ，ＨｉｇｈｌａｎｄｅｒＳＫ，ＳｏｄｅｒｇｒｅｎＥ，ＳａｎｇｅｒａｎｄＴＺ，４５４⁃ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｅｄＴｈｅＨｕｍａｎＭｉｃｒｏｂｉｏｍｅＰＣＲａｍｐｌｉｃｏｎｓ．Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ，ＧｅｎｏｍｅＰｅｔｒｏｓｉｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，ＪＦ，Ｋｎｉｇｈｔ２０１１，Ｒ，２１（３）：Ｂｉｒｒｅｎ４９４⁃ＢＷ５０４．．Ｃｈｉｍｅｒｉｃ１６ＳｒＲＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅｆｏｒｍａｔｉｏｎａｎｄｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｃｏｌｏｇｉｃａ．ｃｎ

ｏｆＲＡ．

ｏｆｐａｔｈｗａｙｓＦＥＭＳｆｕｎｃｔｉｏｎｓ

ｉｎｓｉｔｕ２００８，

ｖｉｅｗ

３２６２００４，Ｂ，

ｉｎ１０９０．ｔｒａｎｓｐａｒｅｎｔａｎａｌｙｓｅｓＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ，３５７．

２００９，Ｍｅｔｈéｄｅｔｅｃｔｉｏｎ