缺氧对神经胶质细胞hif-1基因表达和凋亡的影响

Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｎｅｕｒｏｓｕｒ￣Ｄｉｓ　Ｒｅｓ）２００８；７（５　・４１９・　文章编号：１６７１—２８９７（２００８）０７—４１９一Ｏ３　・论著・　缺氧对神经胶质细胞ｈｉｆ－１基因表达和凋亡　的影响　苏心　摘要张文治　蔡英　（天津市环湖医院神经细胞研究室，天津３０００６０）　目的探讨缺氧环境对培养的新生鼠大脑胶质细胞低氧诱导因子一１（ＨＩＦ一１）基因表达和　凋亡的影响。方法体外培养ｓＤ新生鼠大脑神经胶质细胞；实验分为对照组：正常培养６ｈ（５％　缺氧组ｈｉｆ－１　ｍＲＮＡ表达高于对照组（Ｐ＜０．０１）；　缺氧　ＣＯ　、９５％空气）和缺氧组：缺氧培养６　ｈ（５％ＣＯ：、１％Ｏ：、９４％Ｎ２）。实时定量多聚酶链反应（ＰＣＲ）　方法测定细胞ｈｉｆ－１和ｂｃｌ－２、ｂａｘ基因表达。结果缺氧组ｂｃｌ－２　ｍＲＮＡ表达低于对照组（Ｐ＜０．０５），ｂａｘ　ｍＲＮＡ表达高于对照组（Ｐ＜０．０１）。结果６　ｈ可引起胶质细胞ｈｉｆ　ｍＲＮＡ表达增加但促进细胞凋亡。　关键词低氧诱导因子一１；胶质细胞；缺氧；基因　Ａ　中国图书资料分类号　Ｒ　７３０．２６４文献标识码Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｈｙｐｏｘｉａ　ｏｎ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｈｉｆ－Ｉ　ｇｅｎｅ　ａｎｄ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｏｆ　ｇｌｉａｃｙｔｅｓ　、　ＳＵ　ｎ，ＺＩ／ＡＮＧ　Ｗｅｎｚｈｉ，ＣＭ　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆＮｅｕｒａｌ　Ｃｅｌｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｔｉａ　ｎ　Ｈｕａｎｈｕ　Ｈｏｓｐｉｔｌ，Ｔｉａａｎｉｆｎ　３Ｏ０Ｏ６Ｏ，Ｃｈｉｎａ　Ａｂｓｔｒａｃｔ　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｈｙｐｏｘｉａ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ　ｏｎ　ｇｌｉａｃｙｔｅｓ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ａｎｄ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｈｙｐｏｘｉａ　ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　ｆａｃｔｏｒ一１（ＨＩＦ—１）．Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｒｈｅ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｇｌｉａｃｙｔｅｓ　ｗｅｒｅ　ｒａｎｄｏｍｌｙ　ｄｉｖｉｄｅｄ　ｉｎｔｏ　ｔｗｏ　ｇｒｏｕｐｓ：　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ（ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ　６　ｈ　ｗｉｔｈｏｕｔ　ｈｙｐｏｘｉａ）ａｎｄ　ｈｙｐｏｘｉａ　ｇｒｏｕｐ（ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ　６　ｈ　ｕｎｄｅｒ　ｈｙｐｏｘｉａ）ａｎｄ　ｔｈｅｎ　ｔｈｅ　ｃｅｌｌｓ　ｗｅｒｅ　ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ．　ｒｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ　ｏｆ　ｈｉｌ１．ｂｃｌ－２　ａｎｄ　ｂａｘ　ｇｅｎｅ　ｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ｒｅａｌ　ｔｉｍｅ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）．Ｒｅｓｕｌｔｓ　ｈｉｍ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｈｙｐｏｘｉａ　ｇｒｏｕｐ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ｍｏｒｅ　ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ（Ｐ＜０．０１）ｔｈａｎ　ｔｈａｔ　ｏｆ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ；ｂｅ１－２　ｃｏｎｔｅｎｔ　ｏｆ　ｈｙｐｏｘｉａ　ｇｒｏｕｐ　ｗａｓ　ｌｏｗｅｒ　ｔｈａｎ　ｔｈａｔ　ｏｆ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ（Ｐ＜０．０５）；ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｂａｘ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ｗａｓ　ｈｉｉｇｈｅｒ　ｉｎ　ｈｙｐｏｘｉａ　ｇｒｏｕｐ　ｔｈａｎ　ｔｈａｔ　ｉｎ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ（Ｐ＜０．０１）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｈｙｐｏｘｉａ　ｍａｙ　ｉｎｄｕｃｅ　ｔｈｅ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｈｉｆ－Ｉ　ａｎｄ　ｇｌｉａｃｙｔｅｓ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ　Ｈｙｐｏｘｉａ　ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　ｆａｃｔｏｒ－ｌ；Ｇｌｉａｅｙｔｅｓ；Ｈｙｐｏｘｉａ；Ｇｅｎｅ　低氧诱导因子一１（ｈｙｐｏｘｉａ　ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　ｆａｃｔｏｒ一１，ＨＩＦ一　材料与方法　１）是１９９２年由Ｓｅｍｅｎｚａ等¨　在缺氧诱导Ｈｅｐ３Ｂ细　胞核提取物中发现的，是低氧诱导因子家族中最早发　现的蛋白因子，是缺氧环境的重要调节因子。缺氧是　脑梗死的一个病理学诱因，ＨＩＦ一１在其中发挥了重要　的调节作用　Ｊ。为了探讨缺氧对神经胶质细胞ｈｉｆ－１　基因表达的影响，我们应用实时定量多聚酶链反应　一、实验动物　ＳＤ新生鼠购白天津市实验动物中心。　二、主要试剂和仪器　Ｄｕｂｅｃｃｏｇ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ　ｍｅｄｉｕｍ：ｎｕｔｒｉｅｎｔ　ｍｉｘｔｕｒｅ　Ｆ一１２（１：１）简称ＤＭＥＭ／Ｆ．１２培养液、Ｎ　添加剂、　（ＧｉｂｃｏＢＲＬ），胎牛血清（海克隆生物化学制品有限公　司），小鼠抗大鼠胶质纤维酸性蛋白（ｐｏｌｙａｎｔｂｏｄｙ　ｇｌｉａｌ　（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ，ＰＣＲ）方法，检测体外培养　的新生鼠大脑神经胶质细胞在缺氧环境下ｈｉｆ－１　ｍＲＮＡ的表达及对细胞凋亡的影响。　ｉｆｂｒｉｌｌａｒｙ　ａｃｉｄｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎ，ＧＦＡＰ）、荧光素异硫氰酸酯　（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ　ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ，ＦＩＴＣ）标记的兔抗小鼠　ＩｇＧ（北京中杉金桥生物技术有限公司），Ｏｌｉｇｏ　（ｄＴ）　ＲＮａｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、ＤＬ２０００　ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ（Ｔａｋａ．　作者简介：苏心，主任技师，电话：（０２２）２３３５４９５０－２１５８，Ｅ．ｍａｉｌ　ｓｕｘｉｎ２００￣Ｉ２ｏｏ６＠１２６．ｃｏｍ　＿通讯作者：苏心，主任技师，电话：（０２２）２３３５４９５０－２１５８，Ｅ．ｍａｉｌ　ｓｕｘｉｎ２００６２００６＠１２６．ｃｏｍ　＿ｒａ），１０　ｍＭ三磷酸脱氧核糖核苷　（ｄｅｏｘｙｒｉｂ０ｎｕｃｌａｏｒｉｄｅｔ打ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ｄＮＴＰ，　Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ　4201niJNeurosurgDisRes7(旦)2008；MBI)MMLV逆转录酶(Pro—，mega)SYBRGre，en实时在4．反应扩增条件是：预变性95qC15s、10min；循环步产物bax定量PCR试剂盒(Invitrogen)一。骤95％Jouan，60℃30s，进行50个循环，。PCR二氧化碳培养箱(TGce15，法国)三气培，，2％琼脂糖凝胶上电泳并分析结果105bp，hif1扩增产物120bp，养箱(HERA公司Inc，ll150~，Heuras，德国)实时定量DetectionPCR片段大小是105bp5cbcl2扩增产物片段是，仪器(GeneAm，，p5700SequenceSystem，ABItec扩增产物片段是。90bp3actin扩增产物片段是c美国)电泳仪(EPS2A，200，PharmaciaBioh美国)。HZQ—Q振荡器(东联电子技术开发有限ycle．计算：本实验中得到的数值为，t(threshold公司)1)值Ct值的含义是PCR反应中荧光信号达到。三实验方法、．所设定阈值时的循环数利用公式2~ct计算得到的神经胶质细胞培养和分组：将新生鼠(出生，，值表示起始模板浓、。24h，之内)浸泡在75％酒精消毒剥开颅骨取出大，四统计学方法脑充分剪碎用l000／min．0。l％胰蛋白酶和，0．05％乙二100胺四，本实验采用，SPSS115．录入数据并进行统计学。乙酸二钠消化成单细胞悬液r，过目筛网分析计算结果以采用tx±S表示用Kolm，ogorovSmimov离心收集细胞加入含培养液培养。10％胎牛血清的260I％／rainN!方法检验各指标是否符合正态分布符合正态分布则DMEM／F12，待神经胶质细胞长成单层~检验方法统计学显著性水平定为0，．05。(原代)后将细胞置于37C的空气摇床中，，r摇18h(纯化星形胶质细胞)然后换成含—的结果DMEM／F12培养液并分为对照组(正常培养)和缺一氧组(缺氧培养)分组后细胞分别在不同培养条件，、神经胶质细胞免疫荧光染色结果存在于胞浆内绿色荧光着色为阳性细胞(图1)，下培养637℃、h。正常培养条件：5％，CO：95％、空气O：、GFAP绝对湿度缺氧培养条件：5％，、CO：、l％、94％N2．37C0、绝对湿度。神经胶质细胞鉴定：取培养至第，2代的神经胶质细胞液l、4％to多聚甲醛固定经，3％双氧水／甲醇溶，0．1％TrinnX100．一和非特异性血清处理后加人：100稀释的GFAP3，抗，4℃过夜。0．01mol／L磷酸盐缓冲液洗，遍再用PCRFITC标记的二抗进行免疫。荧光染色荧光倒置显微镜下观察阳性细胞3．实时定量法检测hifbcl2、、baxmRNA，表达：神经胶质细胞缺氧培养6lmh后离心收集细胞加，lTRIzol，提取总BlastRNA。引物设计采用，Generunner软件设计经Inv检索无同源性所有引物由北京。图Fig1SD，新生鼠正常培养第2代神经胶质细胞倒置显微镜(免疫荧，光染色1FITCPassa，×100)cuitrogen生物技术公司合成”确一每组重复5：：”“3次。ge2lturedtaglioeytesofSDneonatalratbyGFAPhif1引物序列为__上游引物3j。CACAGAAGC(immunolfuoresceneeFITCsining，×100)CATCCAAGCGTCTGCAATG下游引物5H“CCACTACGAG二、’枷3，．55：。“’RNA提取结果RNAB．actin引物序列为：上游引物。凹一GAACCCTA紫外分光光度计检测A280产量和纯度。，A260／AGGCCAACCGTG3j。％．下游引物3j：”。AGGCATA介于三、17．～20．之间符合实验要求，CAGGGACAACACAGbcl2一实时定量himPCR、结果一引物序列为：上游引物5。跎一∥”GG：勰。本实验组hif1bcl2PCR、bax、B—actin的测序结果如2。GAGATCGTGATGAAGTAC3j3j下游引物5”5■下；实验组实时定量产物电泳图见图GGAAGGAGAAGATGCCAGbax”’一测序测序结果：引物序列为：上游引物GAGCTGCA卫。AAATCTGGCAATGTCTCCATFACCTGCGAGGATGATIGGAAGTIGCCATC巧‘一3j．下游引物5：CCCAGTrCTCTGAAACTCCAAAGCCACTTCGAAGTAGTCrTGATCCTGCACTGAATCAA0眦3二中华神经外科疾病研究杂志(ChinJGAGGrrrGCAIrrCAAGTrACAGT‘NeurosurgDisRes)2008i三堕j在脑梗死中的作用包括：促进脑缺血缺氧后的微循环重建增加细胞能量代谢参与细胞凋亡的和促，，bcl2一测序结果：ATAACCGGGAGATCGTGATCAACTACATCCATI’ATAAGCTCTCACAGAGGGGCTACGAGTGGCATACTGGAGATGAAGACTCCGCGCCCCTGAGGCCTGCCCCCACCCCTGGCATCTTCTCCTTCC进内源性促红细胞生成素表达增加旧0，而内源性促，红细胞生成素具有内源性的神经保护作用可应用于各种神经组织损伤的治疗1一。正常氧分压条件下HIF，，一通过泛素蛋白水解系统极易被降解低氧条件下．，HIF1因降解途径受阻而积聚，H’。轻度缺氧时，，HIF一bax测序结果：‘1产生缺氧耐受性发挥神经保护作用长期重度缺，GGATGATrGCTGACGTGGACACGGACTC氧时诱导神经细胞凋亡具有神经毒性作用是近年，，CCCCCGAGAGGTCTTCITrCCGGGTGGCAGCTGACATGT丌GCTGATGGCAACTTCAACTGGG来研究细胞缺氧改变的，一个重要指标bcl2∞。。从测定结果观察对照组于缺氧组bax，mRNA，表达量高Bactin测序结果：mRNA表达量低于缺氧组表示细胞。TGAACCCTAAGGCCAACCGTGAAAAGAT缺氧后产生凋亡倾向，基于保护细胞因缺氧造成的，GACCCAGATCATGTITrGAGACCTTCAACACCCCAGCCATGTACGTAGCCATCCAGGCTGTGTTCTCCCTGTATGCCT损伤在该缺氧条件下细胞表达的程被阻断产生，hifI有氧降解过结果，HIF1的堆积加强参与对低氧反应，，的其它信号转导过程以抵抗细胞凋亡的发生。以上测序结果均与GenBank中对应的基因序列一中缺氧早期可见，bcl2．mRNA表达量下降bax致。mRNA，表达量有所增高但细胞是否已启动细胞凋亡，一Ml234机制有待进步探讨。中枢神经系统中胶质细胞的数量是神经元的，、、、、10倍具有营养支持隔离与绝缘引导神经元迁移修2000bp1000bp750bD黑罩一．复与再生免疫应答以及调节神经元的功能等作用、，近年来胶质细胞的作用越来越受到重视所以研究，，500bD胶质细胞缺氧后的生物学行为在认识缺氧性脑损伤，一一一一一…岫一㈨吣咖一一205bp引发的病理变化及损伤后的结构和功能恢复中将有一定的意义。100bp参图2Fig21：考文献2％Ele琼脂糖凝胶cPCRmo产物(对照组)电泳图atmphemgrationf2％cgaxrosegelPCR；2：c(coamntralgrocaupn)produproducctoPCRamiplif；ncaodupramtofbagepnePCRoipliftintionetfhifIgename3：PCRoiplifcationnerodutf31acage：4：PCRiplifcatioproductfbcl2ge统计结果表明±bcl2．mRNA00表达对照组(0±．0101一～～(收稿口期：。o。。一一一00013．)高于缺氧组(0<．00008．)两组之间，．有差异(P0．005．)bax，．mRNA-4表达对照组(000250025)低于缺氧组(00332<．0034m)两组之间有，显著性差异(P0．01)，hif1．RNA-4表达对照组0．(0．1447-40006．)低于缺氧组(0<15980057)两，组之间有显著性差异(P001．)。讨HIF1一论02是缺氧环境的重要调节因子广泛参与哺，。5；修稿日期：2008—06—15)乳动物细胞中缺氧诱导产生的适应性反应。HIF1．