四环素对大鼠局灶性脑缺血的保护作用

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四环素对大鼠局灶性脑缺血的保护作用

张晓明1,穆长征1,马　羽2,李　强3,王冬阳4

(11锦州医学院组织胚胎学教研室;21锦州医学院生理学教研室;

31锦州医学院解剖学教研室,辽宁　锦州　121001;41济南第五人民医院,山东　济南　250000)

【摘要】目的　探讨四环素对SD大鼠局灶性脑缺血损伤的保护作用。方法　将40只大鼠随机分成假手术对照组、缺血模型组和四环素治疗组3组,采用线栓法建立大鼠局灶性脑缺血模型。通过计算大鼠神经功能缺陷评分及死亡率,测量脑梗死体积,观察神经元超微结构的改变,评定四环素的治疗作用。结果　治疗组大鼠神经功能缺陷评分、死亡率及梗塞体积,均显著低于模型组;且神经元超微结构有轻微改变。结论　盐酸四环素可能对缺血性脑组织有保护作用。【关键词】局灶性脑缺血;四环素;大鼠

【中图分类号】　R743131　　　【文献标识码】　A　　　【文章编号】　1000-5161(2004)01-0029-04

TheNeuroprotectionoftheTetracyclineontheFocal

CerebralIschemiainRats

ZHANGXiao-ming,MUChang-zheng,MAYu,LIQiang,WANGDong-yang(DepartmentofHistologyandEmbryology,JinzhouMedicalCollege,Jinzhou121001China)

【Abstract】　Objective　ToexploretheneuroprotectionofthetetracyclineonfocalcerebralischemiainSDrats.　Methods　Toestablishthemodeloffocalcerebralischemiainratswiththesutureoc2cludedmethod.FortySDratswererandomlydividedintothreegroups,theshamoperatedcontrolgroup,thefocalcerebralischemiacontrolgroupandthetetracyclinetreatmentgroup.Thetetracyclinewasinjectedintoabdominalcavitiesofratsintreatmentgroupat1h,4h,24h,32hafteroperation.Whileinthemodelcontrolgroup019%sodiumchloridewasadministered.Toassesstheneuroprotec2tionoftetracyclinebycalculatingneurologicalfunctiondeficientscoresandthedeathrateofrats,mea2suringthevolumesofinfarctionandinspectingthechangesofneuralultrastructure.　Results　Thetetracyclinetreatmentgroupwasmarkedlylowerthantheothergroupsinneurologicscores,thedeathrateandthevolumesofinfarction.Andthechangeswereslightintheneuralultrastructureoftreat2mentgrouprats.cerebralischemia.

　Conclusions　Thetetracyclineislikelytohaveneuroprotectioneffectsonthefocal

【Keywords】　focalcerebralischemia;tetracycline;rat　　任何组织器官的损伤都可伴有炎症反应,脑缺血损伤后的炎症反应是脑组织继发性损害的主要原因之一[1～3],其发生迅速,可持续数天。针对继发性损害理论,人们提出了脑缺血治疗的新思路,通过抑制炎症反应提高治疗效果。盐酸四环素是一种广谱抗生素,临床上用于治疗严重的感染性疾

病,主要是通过抑制蛋白质的产生发挥其抗菌作用的。近年的研究发现四环素还具有其它的作用特性,诸如抗炎、免疫抑制、清除机体氧自由基等。已有证据表明,四环素的半成品药物能显著减轻脑缺血后海马锥体细胞的损伤,对中枢神经细胞有保护作用[4]。探讨四环素的作用特性,不仅有助于

　〔作者简介〕张晓明(1975-),男,河南省驻马店市人,在读硕士研究生,从事脑损伤机理研究。

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锦州医学院学报　2004年2月,25(1)

我们深入了解其作用机制,也为进一步拓宽其临床

作用范围提供依据。

113　统计学分析　四环素组、缺血模型组的死亡

率采用卡方检验,梗死体积百分比及神经功能评分采用t检验。

1　材料与方法

2　结　　果

111　实验动物　雄性SD大鼠40只,体重250～300g,由锦州医学院实验动物中心提供,随机分为假手术对照组(8只)、缺血模型组(8只),四环

211　大鼠死亡率　缺血48h时,四环素组死亡率为813%(2/24),缺血模型组为6215%(5/8),

素治疗组(24只)。112　实验方法

11211　动物模型制作及给药方法　采用左侧颈内

差别具有显著性(卡方检验P<0105)

假手术组全部存活。

生存数

四环素组对照组假手术组2238

(见表1)。

表1　四环素组、对照组、假手术组病死率结果比较

死亡数250

动脉栓法线制成大鼠大脑中动脉栓塞模型

(MCAO)[5～6]:即2%的戊巴比妥钠腹腔麻醉后,正中切口,游离左侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA),颈内动脉(ICA),结扎CCA、ECA,在CCA分叉处切一小口,将头端光滑圆钝直径为0126mm的单股尼龙线插入,沿ICA进入约18mm

合计

24388

病死率(%)

8136215100

　　注:χ2=14131　3P<0105

212　神经功能缺陷评分　大鼠多数于术后30～60min清醒,并在2～3h内观察其神经症状并评分。不出现神经损害症状者(即0分),表示模型

感到有阻力时,即停止进入,将ICA和尼龙线一起结扎,消毒缝皮。假手术组除不插尼龙线外,其余步骤同上。治疗组分别在缺血后1h、4h腹腔注射盐酸四环素45mg/kg,24h、32h注射2215mg/kg;缺血模型组注射等体积生理盐水。

11212　神经功能缺陷评分　造模后48h,根据ZeaLonga等[7]5分制评分(five-pointscale)标准进行神经缺陷评分:0分无神经损伤症状,1分不能完全伸展对侧前肢,2分向对侧转圈,3分向对侧倾倒,4分不能自发行走,意识丧失。1～3分则说明模型成功。11213　梗死体积测定　参照Yang等方法[8],将大鼠于缺血后48h给予过量麻醉剂进行处死,迅速断头取脑并去除小脑和脑干部分,快速-20℃冷冻,自额极3mm向后间隔2mm连续冠状切片,将切片置于2%红四氮唑(TTC)生理盐水中,37℃避光孵育30min后,取出标本立即置于10%中性甲醛固定液内固定。数码相机拍照,将照片输入图像分析仪内进行分析,非缺血区染成红色,梗死区未着色。根据面积与切片间隔等参数计算出梗塞灶体积。11214　电镜标本制作　在术后48h,左室灌注2%的戊二醛100ml进行前固定,取脑,在顶枕部缺血边缘区(前脑额极后约7mm)取1mm3左右脑组织块,戊二醛后固定2h,PBS冲洗,1%的锇酸固定30min,逐级酒精脱水,Epon812环氧树脂包埋,在LKB　UlfrotomeⅢ型切片机上超薄切片,铅铀双染,透射电镜观察。

不成功,不纳入本实验分析结果。除2只大鼠神经功能缺陷评分为0外,其余30只大鼠均出现特征性神经损害症状,如霍纳氏征(瞳孔缩小)阳性。每只大鼠根据ZeaLonga等的5分制标准进行神经功能缺陷评分,功能缺陷越明显,分值越高。四环素组神经功能缺陷评分为1131±0133,明显低于对照组3125±0113(P<0105)。213　梗塞体积(表2)TTC染色后,不着色部位为梗死区域,着红色部位为非缺血区(见图1)。经图像分析仪分析,四环素组梗死体积占全脑体积为(19±3132)%,对照组为(33±3121)%,二者之间比较有显著性差异(P<0105)。

图1　大鼠脑组织TTC染色结果:从左到右,A:假　　

手术、B:模型对照组、C:四环素治疗组。脑组织被TTC染成红色的部分,是非缺血区;未着色的部分,为缺血区

张晓明,等1四环素对大鼠局灶性脑缺血的保护作用31

　　图2　大鼠脑梗塞后的脑组织电镜图片:A　模型对照组显示神经元胞浆内线粒体☆高度肿胀,嵴崩解,空泡变,粗面内质网和核糖体减少,核异染色质边集或溶解,核及核周基质△密度均减低;B　四环素组神经元相对完好,线粒体☆肿胀轻微,无空泡变,核完整,核膜▲轻微波浪形改变,染色质分布比较均匀表2　梗塞占全脑体积百分比及神经功能评分(󰁦x±s)

组别治疗组对照组

tP

例数

248

梗塞体积%

19±3132333±312110141<0101神经缺陷评分

113±01333213±01218100<0101

四环素类药物的抗炎作用减轻梗死后的炎症反应,

有报道认为,四环素类药物作为抗炎性物质,运用于许多感染性疾病,而在脑损伤中,它通过阻止巨噬细胞的活性,在保护缺血区神经元方面可能起主要作用[11～13],另外,四环素类药物的治疗作用通过抑制炎性介质,如前列腺素来发挥作用[14]。第二,基质金属蛋白激酶在脑缺血,可以通过增加血脑屏障的通透性[14],加重缺血后脑组织的损伤,四环素类药物可以抑制基质金属蛋白激酶的活性,保护神经元作用。另外四环素类药物通过抑制级联反应途径、诱导性一氧化氮合酶活性途径参与脑组织的保护[15～16]。四环素类还能够清除氧自由基,脑缺血时氧自由基的大量生成是缺血区神经元细胞损伤的主要因素之一。盐酸四环素还可以与游离Ca2+结合,减少缺血区神经元因Ca2+内流超载而引起的神经元功能紊乱,实现神经元保护作用。

然而,现今对于盐酸四环素神经细胞保护作用的研究还处于动物实验阶段。因四环素及其代谢产物属于大分子物质不易通过血脑屏障,不能存在于正常脑组织中。但脑缺血后血脑屏障会遭到破坏,并且大量抗炎和抗白细胞介质等同类药物的临床应用,都为四环素应用的推广以及脑缺血治疗方法的改善提供了新的思路。

〔参　考　文　献〕

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214　神经元超微结构观察　盐酸四环素组及缺血模型组各取5例的脑标本,每例取2块,对照组显

示神经元胞浆内线粒体高度肿胀,嵴崩解,空泡变,粗面内质网和核糖体减少,核异染色质边集或溶解,核及核周基质密度均减低,突触内结构消失(图2:A)。盐酸四环素组神经元相对完好,线粒体肿胀轻微,无空泡变,核完整,形态正常,染色质分布均匀(图2:B,C)。

3　讨　　论

本实验结果表明:四环素治疗组大鼠,缺血后的脑组织梗死体积与模型组相比明显缩小;动物的死亡率低,且神经功能评分显著低于对照组;电镜结果提示其缺血区神经元损伤较轻微。近年来对沙土鼠全脑缺血模型的研究中发现,四环素类药物可以减少海马锥体神经元细胞的缺失。相关研究也证实,四环素类药物确实是一种有效的神经细胞保护剂[9]。

脑梗塞后缺血区的炎症反应主要表现在白细胞的聚集,氧自由基的产生,溶酶体的破坏,水解酶的生成以及炎症介质的形成等方面。它们不仅能够加重脑血管的栓塞,并且破坏神经细胞的膜磷脂,给损伤后的组织恢复带来不可低估的影响。目前,抗炎、抗白细胞介质的治疗已广泛试用于临床[10],并取得了一定进展。

目前许多研究表明,在局灶性大鼠脑缺血模型中,四环素类药物确实有治疗作用。四环素类药物的神经元保护作用机制涉及以下几个环节:第一,

32

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〔收稿日期〕2003-11-24

胃癌、肾癌双原发1例报告

隋海勇

(葫芦岛市中心医院,辽宁　葫芦岛　125001)

【中图分类号】　R735　　　【文献标识码】　B　　　【文章编号】　1000-5161(2004)01-0032-01　　双原发癌在临床上很少见,现报告1例在同一病人发生的胃癌和肾癌,并对病因及治疗作了简单的分析。

等,大小弯淋巴结及大网膜淋巴结均有转移,7、8、9组淋巴结转移癌(2/3),(右肾)肾细胞癌。

1　临床资料

患者男性,55岁,主诉间断性柏油样便1个月,于

1999年5月10日入院。病史无特殊。入院前经纤维胃镜

2　讨　　论

双原发癌根据Warren所提标准为:(1)每一肿瘤必须证实为恶性肿瘤。(2)每一肿瘤应具有其各自独特的病理学形态。(3)必须排除转移或复发等情况。双原发癌有文献报道发生率仅为0143%～0165%。本例同时发生于消化系统和泌尿系统的双原发癌更是罕见。我国仅于1996年田艳涛等有过1例报道。国外于1998年10月Onishi-T等报道过14例。双原发癌的发生可能与(1)宿主对肿瘤的易感性。(2)机体免疫状态下降。(3)遗传因素。(4)致癌因素对机体的长期作用等有关。但确切的病因至今尚不清楚。近年来双原发癌的发生率有上升趋势,这可能与完备的术前检查及医师对该病的重视有关,此类疾病已引起了临床医师的重视。治疗上应以手术为主,不能将双原发癌认为某一系统癌症的晚期其他脏器转移,而使双原发癌的患者丧失有利的治疗时机。

〔收稿日期〕2003-12-19

检查病理证实为胃低分化腺癌。查体:轻度贫血貌,皮肤及巩膜无黄染。锁骨上及腹股沟淋巴结无肿大。腹平坦,右上腹深压痛,肝脾不大,未触及包块,肝肾区无扣击痛,无移动性浊音,肠鸣音正常。直肠指诊示直肠黏膜光滑,未及结节,前列腺Ⅰ度肿大。术前行CT扫描发现右肾占位性病变,恶性肿瘤可能性大。后行B超及MRI检查均发现右肾有一约115cm×115cm大小的占位性病变,恶性可能性大。于1999年5月20日在全麻下行剖腹探查术。术中肝脏及盆腔未见异常。胃窦小弯侧可及5cm×5cm肿物,浸透全层,横结肠系膜前叶有数个小的癌结节种植。于右肾外缘中部可见一约115cm×110cm的金黄色肿物,肾周脂肪未触及肿大淋巴结,8天拆线,切口一期愈合。切除标本病理组织学回报为胃窦部管状及乳头状腺癌,分化中