烟草CONSTANS同源基因的克隆与分析

烟草CONSTANS同源基因的克隆与分析

陆 莹1,2，刘艳华1，任 民1，牟建民1，张兴伟1,2，孙玉合1，王志德1*

（1.中国农业科学院烟草研究所，青岛 266101；2.中国农业科学院研究生院，北京 100081）

摘 要：日照长度影响植物的生长发育，在拟南芥中CONSTANS是植物光周期开花途径中的关键基因。利用同源序列法结合RACE技术从短日照烟草品种Kutsaga.Mammoth10中分离出了开花时间相关的CO（CONSTANS）同源基因，并命名为NtCO1（基因登录号JN022535.1）。经序列分析，NtCO1全长1493 bp，具有完整的开放阅读框（ORF，81~1292 bp），编码403个氨基酸；具有CO蛋白典型的结构域：氨基末端有两个B-box结构，羧基末端有CCT保守结构域。氨基酸同源性比对发现，NtCO1与茄科CO同源蛋白一致性最高，同马铃薯CO序列一致性达到86.5%；与拟南芥CO蛋白和水稻Hd1氨基酸序列一致性也分别达到50%和43.7%。基因表达分析表明，NtCO1在叶片中优势表达，茎中次之，根中最弱。 关键词：CONSTANS（CO）基因；烟草；克隆；分析；NtCO1 中图分类号：

Molecular Cloning and Analysis of a CONSTANS Homolog from Nicotiana

tabacum

LU Ying1,2, LIU Yanhua1, REN Min1, MU Jianmin1, ZHANG Xingwei1,2, SUN Yuhe1, WANG Zhide1*

(1.Tobacco Research Institute of CAAS, Qingdao 266101, China; 2.Graduate School of CAAS, Beijing 100081, China) Abstract：Day length controls development in many plants. In Arabidopsis thaliana, the CONSTANS (CO) gene is a key component in the photoperiodic pathway controlling floral transition. A novel cDNA encoding a CO homolog was isolated from Nicotiana tabacum cv. Kutsaga Mammoth 10 and designated NtCO1 (GenBank accession number, JN022535.1). The full cDNA sequence was 1493 bp with an open reading frame (ORF) of 1211 bp, encoding a protein of 403 amino acids. The predicted NtCO1 protein contained two B-box-type zinc fingers and a CCT domain. Analysis based on amino acid sequence alignment showed that NtCO1 shared high identity with StCO (86.5%) from Solanum tuberosum, AtCO (50%) from A.thaliana and Hd1 (43.7%) from Oryza sativa. Semi-quantitative RT–PCR analysis showed that NtCO1 was expressed specifically and strongly in leaf tissues but weakly in stem and root tissues.

Keywords: CONSTANS(CO)gene; tobacco; cloning; analysis; NtCO1

开花是植物由营养生长向生殖生长转化的重要过程，光周期是植物开花的重要途径之一。CONSTANS基因（CO）编码一个具有锌指结构的转录因子，是光周期途径中的关键基因[1-2]。Putterill等[3]最早在拟南芥突变体中采用图位克隆的方法分离出CONSTANS基因（CO），CO基因编码的CO蛋白含有与蛋白作用相关的B-box和与核定位有关的CCT（CO、CO-Like和TOC1）两类重要的保守

结构域[4-7]。Yano等对水稻抽穗期的一个重要数量性状基因座利用图位克隆获得Hd1基因[8]，序列分析表明Hd1基因与CO基因同源。利用模式植物拟南芥CO基因和水稻Hd1基因的序列，人们利用同源克隆或筛选文库的方法在小麦[9]、美洲黑杨[10]、马铃薯[11]等多种植物中均克隆到了CO同源基因。

CO基因对光周期的响应起着关键作用，植物首先通过光敏色素（PhyA、PhyB、PhyC、PhyD、

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PhyE）和隐花色素（Cry1、Cry2）2类光受体接受

光信号，CO基因在光受体和生物节律钟的共同调

基金项目：“中国种质资源平台建设”{国烟办综[2005]501号}与“烟草cDNA文库构建及重要基因表达谱研究”（110200701021） 作者简介：陆 莹，女，硕士研究生，研究方向为烟草光周期。E-mail：luying0922@126.com。*通信作者，E-mail：wzdycs@tom.com 收稿日期：2011-12-06 修回日期：2012-06-30

控下，表达量呈现节律性变化，CO蛋白下游基因FT和SOC1的表达控制开花时间[12]。

大多数烟草品种对光照的反应是中性的，只有多叶型品种是典型的短日照作物。目前对于烟草光周期的反应只集中于生理生化的研究[13-15]，但烟草开花的分子机理还不清楚。为更好地理解光周期对烟草开花的分子机制及CO基因的表达模式和功能，本研究以多叶型烟草品种Kutsaga. Mammoth 10为材料，根据马铃薯CO基因序列设计特异引物，克隆获得NtCO1基因，分析其结构特征和组织器官特异性表达。

分别取上述材料各50~100 mg用液氮研磨后，采用Trizol®试剂盒（Invitrogen）提取总RNA，将所提取的总RNA用TE稀释后分别在260 nm、 280 nm紫外光测定OD值。并用1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。NtCO1中间片段获得和基因表达分析所需的cDNA模板，采用Oliga dt（18）和M-MLV逆转录酶（Promega Cat. NO.M1705）合成。利用SMARTTM RACE cDNA 扩增试剂盒（Clontech Cat. NO.634914）分别合成NtCO1基因全长获得所需的5´RACE cDNA和3´RACE cDNA。 1.3 烟草CONSTANS基因的克隆及全长获得

将马铃薯（Solanum tuberosum）CO基因序列

1 材料与方法

1.1 材 料

供试材料为短日照烟草kutsaga mammooth 10（Nicotiana tabacum cv. Kutsaga. Mammoth 10）由国家烟草中期库提供，2011年秋种植于中国农业科学院烟草研究所温室内。种子催芽后播种于育苗盘，发芽后转入光照培养箱（昼/夜温度为27℃/22℃，光照强度为700~900 μmol/ms，光周期8~16 h，湿度保持在65%~75%。）待幼苗期第3片真叶长出时取根、茎（第1、2片真叶之间）和第3片真叶，待营养生长10~12片真叶时取根、茎（第5、6片真叶之间）和第8片真叶，现蕾期取根茎（第13、14片真叶之间）和第15片真叶，液氮速冻后保存于-70℃备用。

1.2 RNA提取与cDNA第一链的合成

2

（基因序列登录号 AM8883.1）在茄科基因数据库（http://solgenomics.net/）内进行比对，获得7条烟草EST序列，使用DNAMAN进行拼接，得到一条拼接序列。根据这一片段，应用引物设计软件Primer Premier 5.0设计一对引物CO-F1和CO-R1。以cDNA第一链做模板进行PCR扩增。扩增产物测序。根据获得序列，设计5´RACE引物CO-R1和3´RACE引物GSP2，以5´RACE cDNA和3´RACE cDNA为模板，以GSP1和GSP2及SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit提供的通用引物UPM，进行PCR扩增，克隆、测序获得5´端序列和3´端序列。将5´端序列和3´端序列进行拼接获得NtCO1基因全长序列。以上引物合成与测序均在英潍捷基（上海）贸易有限公司进行，引物序列信息见表1。

中国烟草科学 表1 本实验所用到的引物 Table 1 Primers used in this study

引物名称 CO-F1 CO-R1

GSP1

GSP2 NUP

CO-YGF CO-YGR

Actin-F Actin-R 序列信息

5´-TCGACCTTTGATTCTTGGCCGTGTTT-3´ 5´-GATGCTGCCTCTCTTTGTGCCTCCTG-3´ 5´-CACTACTTCCCCACCAAACAACATCC-3´ 5´-GGATGTTGTTTGGTGGGGAAGTAGTGG-3´ 5´-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3´ 5´-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3´ 5´-GCAGCAACAACTGGGCAAA-3´ 5´-TTCACACGCCTCGCAAAC-3´ 5´-AAGGGATGCGAGGATGGA-3´ 5´-TACAACTTGCATACGACATAGG-3´ 用途

NtCO1中间片段扩增

5´RACE扩增 3´RACE扩增

RACE扩增通用引物

NtCO1基因表达分析引物

Actin内参基因扩增引物 1.4 烟草CONSTANS基因生物信息学分析 应用Computer pI/Mw Tool软件（www.expasy.org）分析推测NtCO1蛋白质等电点和分子量，蛋白质和DNA同源性分析在NCBI （http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）上用BLAST完成。根据其他物种已报道的CO家族全长序列和本研究克隆得到的共25个序列，用DNAMAN进行多序列比对，使用MEGA4.0通过Neighbor-joining（NJ）方法构建NtCO1分子进化树，并进行Bootstrap检测。 1.5 烟草CONSTANS表达分析 利用primer premier 5.0生物软件设计半定量RT-PCR目的基因特异引物（表1），采用Actin基因作为内参基因，使用TAKARA EX Taq HS酶。PCR反应程序：94 ℃，3 min；94 ℃，30 s； 60 ℃，30 s；72 ℃，60 s；30个循环。72 ℃延伸5 min。PCR扩增产物经2.0%琼脂糖凝胶电泳分离，AlphaImager EP凝胶成像系统观察结果，3次重复。

®图1 烟草总RNA提取、NtCO1基因中间片段、5´RACE、和3´RACE扩增 Fig. 1 Total RNA extracted from tobacco, amplification of the middle fragment, PCR products of 5´RACE and 3´RACE 注：A,1（总RNA，28s和18s条带）；B,2（中间片段扩增产物）；C,3（5´RACE 扩增产物）；D,4（3´RACE扩增产物）；M1（DL2000 DNA Marker）；M2（D2000 DNA Marker）。 2 结 果 2.1 NtCO1基因的克隆 使用引物CO-F1和CO-R1进行以总cDNA为模板获得一条900 bp的片段（图1B）。克隆测序，所得序列经NCBI-BLAST检索发现与CONSTANS基因有很高的同源性，确认该序列是目的片段。利用该片段设计5´RACE引物GSP1和3´RACE引物GSP2，经过5´RACE和3´RACE扩增分别获得 654 bp和863 bp的PCR产物（见图1C和图1D）。测序后发现，5´和3´端序列与已知中间片段有重叠，为烟草CONSTANS基因mRNA的5´和3´端序列。3个序列经DNAMAN软件拼接后得到了烟草

烟草CONSTANS同源基因的克隆与分析

CONSTANS基因完整cDNA序列，全长1493 bp，在命名为NtCO1，GenBank登录号为JN022535.1。 2.2 NtCO1基因编码蛋白质的分析

序列分析表明该基因含有一个1211 bp的编码区，编码403个氨基酸（见图2）。预测相对分子质量为44.8 kD，等电点pI=5.28。与所报道的其他植物的CO蛋白质性质相似。经SMART程序在线预测，NtCO1蛋白无跨膜结构与信号肽，为水溶性蛋白。

（Arabidopsisthaliana）AtCO和水稻（Oryza sativa）Hd1氨基酸序列一致性依次为50.0%和43.7%。从进化树上可以看出，NtCO1与茄科植物马铃薯CO、番茄CO聚为一类，小麦、毒麦和玉米等禾本科植物聚为一类，拟南芥、芥菜和甘蓝等十字花科植物聚为一类。

图3 NtCO1同其他物种的CO、COLS的进化树分析 Fig. 3 Phylogenetic relationship of NtCO1 with CO and COLs in other species

图2 NtCO1基因的推测氨基酸序列同AtCO（拟南芥）和OsHd1（水稻）的多序列比对

Fig. 2 Alignment of the constans homologs from Arabidopsis (AtCO), rice (OsHd1),and tobacco(NtCO1)

2.4 NtCO1基因表达分析

RT-PCR分析表明，NtCO1在烟草不同发育时期的根、茎和叶片中均有表达（图4）。在幼苗期根、茎、和叶片中表达丰度极低。在营养生长阶段，在叶片中优势表达，在茎中次之，根中最弱。生殖生长阶段，在茎和叶片中优势表达，根中较弱。

对预测的NtCO1蛋白序列分析发现,在氨基末端有2个串联的锌指结构域—B-box（15~57；58~100），羧基末端有1个CCT结构域（334~378）（图2）。每个B-box包含1个有4个半胱氨酸组成的C-X2-C-X16-C-X-C的特殊结构。CCT结构域大约有43个碱基组成。

2.3 NtCO1序列一致性比较和进化树分析

分析NtCO1氨基酸序列同源性比对和分子进化树表明（图3），各物种间在B-box结构和CCT结构域2个区域的同源性很高，其它区段CO蛋白的同源性较低。NtCO1氨基酸序列同马铃薯CO一致性最高，为86.5%。NtCO1与拟南芥

图4 NtCO1在烟草的表达分析 Fig. 4 Expression of NtCO1 in tobacco.

3 讨 论

预测蛋白保守性分析表明NtCO1具有CONSTANS家族典型的B-box和CCT结构域。

中国烟草科学

NtCO1蛋白与马铃薯CO一致性高达86.5%，与模式植物拟南芥AtCO蛋白的一致性也达到50%。就B-box结构域进行比较，NtCO1与AtCO一致性达到77.9%；而CCT结构域一致性达到83.7%。由此可初步推断，NtCO1与马铃薯CO基因为同源基因，属于CONSTANS家族成员之一，与拟南芥AtCO基因为同源基因。

CONSTANS基因在植物基因组中是多拷贝基因家族。在拟南芥中有17个成员[7]，水稻种也有16个成员[16]，拟南芥中CONSTANS蛋白家族根据N末端B-box结构特征分为三类：第一类是在N末端具有2个B-box结构；第二类是在N末端只有1个B-box；第三类是在N末端有1个正常的B-box和1个二级结构改变的B-box锌指结构。NtCO1具有两个正常的B-box结构，可以认为NtCO1应属于家族成员中的第一类。

通过基因表达分析可以看出，NtCO1基因有时空表达差异，在烟草开花的的途径中可能起重要的作用。其他物种中CO同源基因对植物开花时间起着重要的作用，牵牛花的PnCO基因则可以弥补拟南芥co突变体的晚花表型并使其比野生型拟南芥开花期提前[17]。油菜BnCO1基因可以互补拟南芥co-2突变体的晚花表型[18][J]. Cell, 1995, 80: 847-857.

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