新的细胞毒类抗肿瘤药

提 要

白附子（Rhizoma Typhonii，Giant Typhoniumh Rhizome），为天南星科植物独角莲（Typhonium giganteum Engl.）的块茎。我们对其抗肿瘤作用和机理进行了研究。通过选择不同极性的溶液提取白附子不同组分，采用细胞生物学实验完成对提取所得各组分抑制肿瘤细胞增殖活性的筛选，确定具有抑制肿瘤作用的有效组分，再进一步分离纯化，最后筛选出具有抑制肿瘤细胞生长作用的E2Ⅰ组分。对Ｅ２组分进行动物实验，也发现Ｅ２组分在接种Ｓ－１８０肿瘤小鼠体内具有抑制肿瘤生长的作用。然后通过ＳＯＤ活力，过氧化氢酶活力，核糖核酸酶活力的体外实验和小鼠体内各项生化指标的变化初步阐述白附子抗肿瘤的机理。所得　各组分通过纸层析和薄层层析初步确定所含物质的种类。对其中一个有效纯组分通过红外、紫外、核磁等光谱初步确定样品Ｘ为丁二酸。　

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前　　　　言　

一、　肿瘤药物的研究新进展　

近几年来，肿瘤治疗取得了相当的进步，肿瘤患者生存时间明显延长，分子肿瘤学、分子药理学的发展使肿瘤本质正在逐步阐明；高通量药物筛选、组合化学、基因工程等先进技术的发明和应用加速了药物开发进程；抗肿瘤药物的研究与开发已进入一个崭新的时代。当今抗肿瘤药物的发展战略有以下几点：（１）以占恶性肿瘤９０％以上的实体瘤为主攻对象；（２）从天然产物中寻找活性成分；（３）针对肿瘤发生发展的机制，寻找新的分子作用（酶、受体、基因）靶点；（４）高通量药物筛选（High-through put screening）；（５）新技术的导入和应用：组合化学、结构生物学、计算机辅助设计、基因工程、ＤＮＡ芯片、药物基因组学（功能基因组学与药理学结合）等。　

　　　　抗肿瘤药物正从传统的细胞毒性药物，向针对机制的多环节作用的新型抗肿瘤药物发展，目前国内外关注的抗肿瘤作用的新靶点和相应的新型抗肿瘤剂或手段有：（１）以细胞信号转导分子为靶点：包括蛋白酪氨酸抑制剂、法尼基转移酶抑制剂、ＭＡＰＫ信号转导通路抑制剂、细胞周期剂；（２）以新生血管为靶点：新生血管生成抑制剂；（３）减少癌细胞脱落、黏附和基底膜降解：抗转移药；（４）以端粒酶为靶点：端粒酶抑制剂；（５）针对肿瘤细胞耐药性：耐药逆转剂；（６）促进恶性细胞向成熟分化：分化诱导剂；（７）特异性杀伤癌细胞：（抗体或毒素）导向治疗；（８）增强放疗和化疗的疗效：肿瘤治疗增敏剂；（９）提高或调节机体免疫功能：生物反应调节剂；（１０）针对癌基因和抑制癌基因：基因治疗—导入野生型抑癌基因、自杀基因、抗耐药基因及反义寡核苷酸、肿瘤基因工程瘤菌等。　

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１．　新的细胞毒类抗肿瘤药　

　　　　目前或在相当一段时期内，传统细胞毒性药物仍将是肿瘤药物治疗的主体。细胞毒性药物的主要缺陷是对实体瘤疗效差，不良反应大，易产生耐药性。因此，细胞毒性药物的发展战略是：（１）针对实体瘤，改进筛选方法，提高筛选效率；（２）重视从天然产物（植物、海洋生物等）中寻找新的化学结构；（３）针对关键靶点如拓扑异构酶（TOPO）、微管系统（ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ　ｓｙｓｔｅｍ）、胸腺嘧啶脱氧核苷酸合成酶（ＴＳ）、ＤＮＡ聚合酶（ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）、ＤＮＡ引物酶（ＤＮＡ　ｐｒｉｍａｓｅ）等，提高选择性；（４）克服耐药性。近１０年来，细胞毒性抗肿瘤药物的研究和开发有了明显的进展［１］，美国国家癌症研究所（ＮＣＩ）与制药公司和科研机构合作，现有一批前景良好的新化合物正在临床Ⅰ期研究阶段。　　　　　一些已投入临床使用或临床Ⅱ、Ⅲ期试验取得较理想效果的抗肿瘤新药有［２］。　

１．１拓扑异构酶抑制剂　　　　真核细胞ＤＮＡ的拓扑结构由两类关键酶ＴＯＰＯ

Ⅰ和ＴＯＰＯⅡ调节，这两类酶在ＤＮＡ复制、转录、重组，以及在形成正确

的染色体结构，染色体分离、浓缩中发挥重要作用。ＴＯＰＯⅠ抑制剂主要为喜树碱类化合物，近年发展了２个新的喜树碱类药物，即拓扑特肯

［３］［４，５］（ｔｏｐｏｔｅｃａｎ）和依莲洛特肯（ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ），　临床上主要对卵巢

癌、小细胞和非小细胞性肺癌、宫颈癌、结直肠癌、前列腺癌等疗效较好，其他ＴＯＰＯＩ抑制剂还有　９Ａ　Ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ，　Ｃａｍｐｏｔｏｓａｒ，　ＤＸ８９５１等。由于ＴＯＰＯＩ与ＤＮＡ片断共价结合及非共价复合物的三维晶体结构已于最近阐明［６，７］，新ＴＯＰＯＩ抑制剂的寻找又成为热点，发展喜树碱类药物的口服制剂以提高治疗指数也显得越来越重要。ＴＯＰＯⅡ抑制剂种类较多，　近年来临床上疗效较好的有ＤＮＡ嵌入型的阿霉素衍生物去甲柔红霉素　（ｉｄａｒｕｂｉｃｉｎ）、吡喃阿霉素　（ｐｉｒａｒｕｂｉｃｉｎ）和非ＤＮＡ嵌入型的鬼臼毒素

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类药物鬼臼噻吩甙　（ｔｅｎｉｐｏｓｉｄ，ＶＭ２６）等。原有抑制剂的改造又发现了一批新的ＴＯＰＯⅡ抑制剂，如蒽环类抗生素ＭＸ２，　ＡＤ３２，　ＡＤ１９８，　ＡＤ３１２　，　吡啶并咔唑衍生物Ｓ１６０２０２［８～１０］都进入了临床研究阶段。中国科学院上海药物研究所最近从药用植物红根草中提取到有效成分，　经修饰后得到一个全新的抗肿瘤化合物沙尔威辛（ｓａｌｖｉｃｉｎｅ）　［１１，１２］，　也是ＴＯＰＯⅡ抑制剂　，体外实验显示其对肺癌、胃癌等疗效明显，现已完成临床前研究工作。　

１．２微管蛋白活性抑制剂　　　　研究表明，　有大量天然和合成化合物能干扰微管蛋白的功能。它们主要是与微管作用，　抑制微管聚合，使纺锤体无法形成，　从而使细胞停止在有丝中期；或是促进微管聚合、抑制微管解聚而抑制细胞。微管蛋白活性抑制剂是最有效的抗肿瘤药物之一，紫杉醇类药物是近年来发现的新作用机制的细胞毒类抗肿瘤药物，　紫杉醇及其衍生物紫杉特尔　（ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）能促使微管蛋白迅速聚集成微管，　并结合到微管上抑制微管的解聚，　从而使细胞有丝中止。临床上对卵巢癌、乳腺癌、非小细胞性肺癌、头颈部恶性肿瘤等有显著的疗效［１３～１８］。由于紫杉醇溶解度很差，　不良反应大和耐药性的产生，　许多研究机构正在探寻新的紫杉醇衍生物［１９］，并开发缓释等新剂型。　

１．３其他　　　　胸腺嘧啶脱氧核苷酸合成酶　（ＴＳ）把单磷酸脱氧尿嘧啶　（ｄＵＭＰ）转换成单磷酸胸腺嘧啶（ＴＭＰ），　是ＤＮＡ合成过程中的关键酶之一。近年来发展了一系列新的ＴＳ特异性抑制剂［２０，２１］，　其中最著名的是ｄａｌｔｉｔｒｅｓｅｄ　（Ｔｏｍｕｄｅｘ）。Ｒａｌｔｉｔｒｅｘｅｄ是水溶性的ＴＳ特异性抑制剂，　不影响ＲＮＡ合成等其他细胞内生命活动，　因而不良反应较小［２２，２３］。临床试验中单药或与其他抗癌药　（如　５ＦＵ，ＣＰＴ１１，ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ）及放射线治疗联用，对头颈部恶性肿瘤、前列腺癌、肺癌、结直肠癌、胃癌、软组织

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肉瘤、白血病等有较理想的疗效［２３］。第三代铂类抗癌药物奥沙利铂　（ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ）和萘达铂　（ｎｅｄａｐｌａｔｉｎ）在临床试验中取得了良好的反响。一项国际多中心临床ＩＩＩ期试验表明奥沙利铂与　５ＦＵ联合应用，　对大肠癌的总缓解率超过５０　％［２４］。目前，　奥沙利铂已被认为是治疗晚期大肠癌的一线药，　与ＴＯＰＯＩ和ＴＳ抑制剂的联合化疗试验正在美国、欧洲、中国等地进行中。萘达铂的肾脏毒性较小，　临床ＩＩ期试验表明其对肺癌、头颈部恶性肿瘤、睾丸和女性生殖系统肿瘤有明显的疗效［２５］。　２．　以细胞信号转导分子为靶点的抗肿瘤药物　　　　　

细胞的活性受外部信号控制，　外部信号转导到细胞内部引起细胞内的一系列反应，　这一过程称为信号转导。信号转导包括多种细胞内途径，　最经典的为丝裂原活化的蛋白激酶　（ＭＡＰＫ）信号转导通路，　在肿瘤生长、转移过程中起重要作用的一些生长因子及其受体都是通过ＭＡＰＫ信号转导通路起作用的。细胞信号转导异常，　导致恶性肿瘤快速增殖、无限生长。针对ＭＡＰＫ信号转导通路的各个环节研究ＭＡＰＫ通路特异性抑制剂，　从理论上讲可以从根本上防治恶性肿瘤，　现介绍两类研究最活跃［２６］、进展较快的细胞信号转导过程中关键酶的抑制剂。　

２　．１蛋白酪氨酸激酶　（ＰＴＫ）抑制剂　　　　ＰＴＫ是一组酶系，　能催化ＡＴＰ上的磷酸基转移到许多重要的蛋白质的酪氨酸残基上，　使其残基磷酸化，　从而激活各种底物酶，　通过一系列反应影响细胞的生长、增殖和分化。真核细胞的生长因子如ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、胰岛素受体和许多癌基因的表达产物都具有ＰＴＫ活性。多数肿瘤细胞ＰＴＫ活性异常升高，　因此ＰＴＫ是一个非常重要和有价值的抗肿瘤靶点［２７］。目前ＰＴＫ抑制剂主要有黄酮类、肉桂酰胺类、苯乙烯类、苯和苯胺类、二底物型抑制剂、吡哆嘧啶类、吡哆并喹唑啉和联硒双吲哚类等。来源于天然产物的有三羟异黄酮，　ｅｒｂｓｔａｔｉｎ，ｌａｖｅｎｄｕｓｔｉｎ　Ａ，　ｈｅｒｂｉｍｙｃｉｎ　Ａ等；其中，　ｅｒｂｓｔａｔｉｎ是ＰＴＫ

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的双底物竞争性抑制剂，　ｈｅｒｂｉｍｙｃｉｎＡ则是一种不可逆的共价抑制剂；　这种奇特的作用方式将为发展新型ＰＴＫ抑制剂提供思路。合成的ＰＴＫ抑制剂有ｔｙｒｐｈｏｓｔｉｎ，　它是基于ｅｒｂｓｔａｔｉｎ和酪氨酸的结构设计的，　随后又发展了多种结构各异的抑制剂。迄今为止，　已证明许多ＰＴＫ抑制剂有抗癌活性，　ＰＴＫ抑制剂与其他抗癌药物合用治疗癌症也取得了一些可喜的成果。小分子肽类受体酪氨酸激酶　（ＲＴＫ）抑制剂的研究已取得显著的进展［２８］，　如具有ＲＴＫ活性表皮生长因子（ＥＧＦ）受体小分子肽类抑制剂ＰＤ１５８７８０，　ＰＤ１６９５４０，　ＣＬ３８７７３５，　ＺＤ１８３９，　ＣＰ３５８７４４，　ＣＧＰ５９３２６，　ＣＧＰ５９３２６Ａ等在体内外试验中显示出很强的抗肿瘤活性，已准备进入临床试验；具有ＲＴＫ活性的血小板源性生长因子　（ＰＤＧＦ）受体小分子肽类抑制剂ＰＤ１６６２８５可明显延长荷瘤裸鼠的生存时间；ＳＵ１０１已进入ＩＩＩ期临床试验，且因其能增加细胞毒类抗肿瘤药物ＢＣＮＵ的作用，正在准备将两药合用进行ＩＩ期临床试验。　

２　．２法尼基转移酶　（ＦＴａｓｅ）抑制剂　　　　Ｒａｓ癌变基因的表达产物Ｒａｓ蛋白存在于多数肿瘤之中，　Ｒａｓ蛋白是一种三磷酸鸟苷　（ＧＴＰ）的结合蛋白，　细胞有丝。Ｒａｓ蛋白在细胞增殖和恶性转化方面起重要作用，　其最终须与胞浆膜结合才能发挥生物学效应，　从胞浆到胞膜需要Ｒａｓ蛋白的翻译后修饰，　即从半胱氨酸残基法尼基化开始，　法尼基化后，　３个Ｃ末端的氨基酸残基被蛋白酶水解；法尼基基团的结合使分子容易插入到胞膜中，　这是Ｒａｓ成熟必须的第一步。ＦＴａｓｅ是近年来发现的与Ｒａｓ蛋白异戊二烯化修饰密切相关的一种必需酶，　抑制ＦＴａｓｅ活性，　阻止Ｒａｓ蛋白法尼基化，　可以有效地抑制肿瘤细胞的增殖［２９］。正在进行临床前和临床研究的ＦＴａｓｅ抑制剂（ＦＴ１ｓ）可分为：①法尼基二磷酸（ＦＰＰ）竞争性ＦＴａｓｅ抑制剂（ＦＰＰｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ　ＦＴＴＩｓ）：　ＦＰＰ是ＦＴａｓｅ作用底物之一，　被ＦＴａｓｅ的α亚基所识别，　法尼基转移到受体肽上需与Ｍｇ２＋配位；这一

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机制为设计ＦＴＩｓ提供了思路。这类ＦＴＩｓ有ＭａｎｕｍｙｃｉｎＡ，　Ｌ７０４２７２，　ＢＭＳ１８６５１１，　Ｊ１０４８７１

［３０］

等正在进行临床前研究。②ＣＡＡＸ　

ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅＦＴＩｓ：　ＦＴａｓｅ催化的法尼基反应是在Ｃ端具有ＣＡＡＸ序　（其中Ｃ为半胱氨酸，Ａ常为脂肪类氨基酸，Ｘ常为甲硫氨酸、丝氨酸、丙氨酸或谷氨酸　）的Ｒａｓ蛋白，　如ＲａｓＢ，　ＫＲａｓＢ，　ＮＲａｓ，　ＨＲａｓ等。基于所需ＣＡＡＸ的结构特征与酶构象上的适应性，现已设计并合成了具有ＦＴａｓｅ识别与结合的Ｒａｓ蛋白Ｃ端ＣＡＡＸ序四肽结构特征的肽模拟，　如Ｌ７３９７４９，　Ｌ７３９５５０，　Ｌ７４４８３２，　Ｌ７４５６３１，　ＦＴＩ２　７６，　ＦＴＩ２７７，　Ｓｃｈ４４３４２，Ｓｃｈ　５４３２　９，　Ｓｃｈ６６３３６，　Ｓｃｈ５９２２８等，　抑制有ＨＲａｓ，　ＫＲａｓ和ＮＲａｓ突变的恶性肿瘤，其中Ｓｃｈ６６３３６已进入Ｉ期临床研究［３１］。　３．肿瘤新生血管生成　（ＴＡ）抑制剂　

原发肿瘤的生长和转移是依赖于新生血管生成（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）的。肿瘤既可通过肿瘤血管从宿主获取营养和氧气，　又可通过肿瘤血管源源不断地向宿主输送转移细胞，　并在机体的其他部位继续生长和诱导血管形成，　导致肿瘤转移。肿瘤的血管系统已成为一个崭新的、有希望的抗肿瘤治疗靶点。人们正致力于开发和研究能破坏或抑制血管生成，　有效地阻止肿瘤生长和转移的药物，　这类药物称为ＴＡ抑制剂，　是当今新型抗肿瘤药物研究最活跃的领域之一。ＴＡ抑制剂治疗具有许多优势：　①肿瘤发生时，血管形成已被启动，故具有良好的特异性；②血管内皮细胞暴露于血流中，药物能直接发挥作用，故剂量小、疗效高、不良反应小；③内皮细胞基因表达相对稳定，不易产生耐药性。目前已有　２０余种ＴＡ抑制剂分别进入Ｉ至ＩＩＩ期临床试验［３２～３４］。　我国的科研工作者也开始进行ＴＡ抑制剂的寻找和研究工作，取得了一些进展。如中国科学院上海药物研究所发现来源于植物的天然化合物ＰＡＡ和ＰＡＢ具有对抗血管形成作用，　这些化合物具有较强的抗肿瘤活性。２１世纪初，　ＴＡ抑制剂将在

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临床上正式应用；我国也正在急起直追，争取具有自主知识产权的ＴＡ抑制剂早日进入开发阶段。　４．肿瘤耐药逆转剂　（ＲＲＡ）　

临床化疗失败的重要原因是肿瘤细胞对化疗药物产生耐药性，　大多数肿瘤患者的死因与耐药直接或间接相关。因此，　寻找耐药逆转剂是抗肿瘤药物研究的重要策略之一。肿瘤耐药多为多药耐药（ＭＤＲ），　也有单药耐药，　产生的可能原因是药物代谢障碍、ＤＮＡ修复机制障碍、ＤＮＡ多聚酶活性改变等。另外，　耐药是凋亡抑制的表现。一些与凋亡抑制相关的癌基因（如ｂｃ１２，ｂｃｒ／ａｂ１，　ＮＫκＢ等）的表达产物可阻断或阻碍多种因素（如化疗药物、辐射、激素等）诱导的肿瘤细胞凋亡，　产生耐药性。在多种ＭＤＲ细胞系中ｂｃ１２水平显著升高，　是又一个佐证。多药耐药逆转战略为：　以ｐｇｐ及上述耐药相关蛋白为作用靶点，　筛选、设计合成耐药相关蛋白逆转剂；寻找对耐药肿瘤有效的凋亡诱导剂。目前正在研究中的作用于ｐｇｐ的逆转剂有［３５］：①钙拮抗剂，　主要有ｅｒａｐａｍｉｌ及其衍生物等，在ｍｄｒ１翻译水平抑制ｐｇｐ合成及其活性，部分药物已在临床使用；②钙调蛋白拮抗剂，包括ｃｈｌｏｒｐｒｏｍａｚｉｎｅ等吩噻嗪类衍生物，已进入临床试验；③环孢菌素类，环孢菌素Ａ及其结构类似剂ＰＳＣ８３３，　ＳＤＺ２８０４６６等，　阻断Ｐｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ，　能改变抗癌药物的药代动力学，　已显示出良好的临床应用前景；④喹啉类，ｑｕｉｎｉｄｉｎｅ等已进入临床试验，疗效不理想；⑤抗雌激素类化合物，其中ｔａｍｏｘｉｆｅｎ研究较深入，　ｔａｍｏｘｉｆｅｎ与ｖｅｒａｐａｍｉｌ合用疗效更好。以上药物大多不良反应较大，疗效报道不一。其他耐药逆转剂有［３６］：①反义核酸与核酶：针对ｍｄｒ１的反义核酸或核酶，破坏肿瘤细胞ｐｇｐｍＲＮＡ的表达；临床应用需要合适的转移载体；②细胞因子ＴＮＦα；③ＧＳＨ耗竭剂ＶｉｔａｍｉｎＫ３　，ＢＳＯ（丁硫氨酸亚砜胺）；④蛋白药物交联剂等。理想的ＭＤＲ逆转剂应具备以下条件：①

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安全，对正常组织毒性小；②在体内及肿瘤细胞能达到体外有效浓度；③本身具有一定的抗肿瘤活性；④稳定、体内半衰期较长；⑤其代谢物也有效。　５．反义药物　

　　　　反义寡核苷酸　（ＡＳＯＤＮ）具有特异性抑制基因表达的能力。随着快速基因克隆、测序技术及快速自动ＤＮＡ化学合成技术的出现，　ＡＳＯＤＮ的研究已进入蓬勃发展时期。针对肿瘤的反义药物的研究较早，　迄今为止已有十几种ＡＳＯＤＮ　试用于临床。选择的反义靶点主要包括：①癌基因类：ｃｍｙｃ，ｃｍｙｂ，　ｂｃ１２，　ＮＲａｓ，　ＫＲａｓ，ＨＲａｓ，ｃｊｕｎ，ｃｆｏｓ，ｃｄｃ２和ｃｍｏｓ等；②宿主基因类：多药耐药基因、周期素（ｃｙｃｌｉｎ）、前胸腺素、Ｔ细胞受体、表皮生长因子受体、蛋白激酶Ｃ等；③细胞因子类：ＩＬ２，　ＩＬ１１α，　ＩＬ１β等；④病毒类：人Ｔ淋巴细胞病毒、Ｒｏｕｓ肉瘤病毒等；⑤抑癌基因类：ｐ５３等。ＡＳＯＤＮ作为一种治疗药物用于抗肿瘤治疗［３７］，　是目前最有可能应用于临床的基因疗法，　但尚有许多问题亟待解决并进行充分评价

［３８］

，　如　：①提高ＡＳＯＤＮ在体内和细胞内的稳定性；②增强ＡＳＯＤＮ导入靶

细胞的能力和效率；③作为药物必须合成足够量，　并要降低成本；④研究ＡＳＯＤＮ体内代谢专一性分布情况；⑤ＡＳＯＤＮ的专一性效能和非专一性作用的意义；⑥ＡＳＯＤＮ的作用机制；⑦ＡＳＯＤＮ及其代谢物的安全性、不良反应，　尤其是长期毒性；⑧ＡＳＯＤＮ作为药物在管理中的特殊问题。　６．基因治疗　

　　　　自本世纪　９０年代初开始，　生物治疗已发展到基因治疗阶段。针对肿瘤进行基因治疗，为抗肿瘤治疗开辟了广阔的前景［３９］。主要方法包括：①细胞因子基因疗法：　通过体外／体内法转导细胞因子基因，调节免疫反应；②药物敏感基因疗法：　即自杀基因疗法；③多药耐药基因疗法：将多药耐药基因转到骨髓造血干细胞，结合大剂量化疗抗肿瘤；④基因

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置换或补充：置换突变的癌基因或补充缺失的抑癌基因；⑤反义核苷酸技术：　用于抑制癌基因的表达；⑥肿瘤基因工程瘤苗：　即利用基因重组技术，将目的基因导入受体细胞而制备的瘤苗；可用于肿瘤术后的转移、复发及术中无法清除的残留灶的治疗。目前研究得最深入最广泛的是Ｐ５３　基因治疗，一项Ｉ期临床试验表明局部注射携带Ｐ５３　基因的腺病毒，　可导致一部分肺癌和头颈部肿瘤消退［４０］。这个试验结果令人鼓舞，　但基因治疗仍须与传统的抗肿瘤药物一起应用，　两者可能有协同作用。　７．端粒酶抑制剂　

端粒酶　（ｔｅｌｏｍｅｒｅａｓｅ）是一种ＲＮＡ依赖的ＤＮＡ聚合酶，能以本身ＲＮＡ为模板，在染色体末端合成六聚脱氧核苷酸ＴＴＡＧＧＧ的重复序列，以补偿细胞时的染色体末端缩短，解决“末端复制问题”。端粒酶存在于绝大部分正常人体细胞，但在肿瘤细胞中广泛表达，提示它可能为恶性肿瘤细胞无限增殖所必需。抑制端粒酶的活力，将有可能阻止肿瘤细胞恶性增殖；因此，端粒酶抑制剂有望成为一种高效低毒的新型抗肿瘤药［４１］。端粒酶抑制剂研究策略［４２］：①针对端粒酶ＲＮＡ组分ｈＲＴ或催化亚基ｈＴＥＲＴ的ｍＲＮＡ设计反义核苷酸；②用小分子化合物抑制ｈＴＥＲＴ的活性中心；③破坏底物端粒的结构，如破坏端粒的鸟嘌呤四聚体；④针对其他一些未知相关蛋白干扰酶和底物的结合；⑤利用端粒酶间接抑制剂端粒酶的活力，　如蛋白激酶Ｃ抑制剂、肿瘤细胞诱导分化剂等。端粒酶抑制剂的有关研究显示出了良好的发展趋势，但是当前对端粒动力学及端粒酶的作用、机制认识尚不深入，所以，要将端粒酶抑制剂最终应用于治疗恶性肿瘤尚需更深入的研究和探索。　二、　临抗肿瘤用药情况[43-46]

根据全国医药经济信息网2001年第1季度14个城市219家医院进药信息统计，抗肿瘤药物总的销售金额达到1.35亿元人民币，其中随着

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抗肿瘤辅助药物日益得到人们的关注，其它抗肿瘤药物的销售金额最高，其次是抗肿瘤抗生素类(各大类具体份额详见图1)。从1999年到2001年1季度9个季度的抗肿瘤药物各大类销售趋势图（图2）中可见，其它抗肿瘤药物、抗肿瘤中草药和抗肿瘤抗生素的销售金额呈上升趋势，抗代谢药和烷化剂的销售趋势上看，有轻微的下滑。

在我国抗肿瘤药物的研究和生产都取得了很大的进展，并从单一的化学治疗进入了联合化疗和综合化疗的阶段，这为新药的研发提出了更多的挑战和机遇。　

图１：２００１年第一季度抗肿瘤药物大类销售金额拼图　

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图2：1999年至2001年1月抗肿瘤药物各大类药品销售趋势图 三、立题依据及介绍

综上所述，但现在新型抗肿瘤药物的发现仍是一个焦点，其中从已有的动、植物中草药中分离、提出未知的具有有效生物活性的药物仍是一大研究热点。

中药白附子（Giant Typhoniumh Rhizome），又称为禹白附、牛奶白附、红南星，为天南星科植物独角莲（Typhonium giganteum Engl）的块茎。中国药典I部中有收载，主治祛风痰，定惊搐，解毒散结止痛。用于中风痰壅、口眼歪斜、语言涩謇、痰厥头痛、偏正头痛、喉痹咽痛、破伤风症；外治瘰疲痰核、毒蛇咬伤。其主要成分有β- 谷甾醇及其葡萄糖甙、肌醇、粘液质、蔗糖等。据伤寒杂病论的记载白附子很早就是一味治疗肿瘤的良药，但其作用活性及机理还没有报道，我们的实验就是对白附子的抗肿瘤活性及机理进行研究。

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图3：独角莲及白附子

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第一部分 分离提纯与鉴定

对白附子的初步分离主要是根据白附子中各种成分在不同溶剂中的溶解性质，选用不同极性溶剂分离出来。之后进一步分离纯化是根据不同组分与硅胶柱亲和力的差别，用不同极性溶剂洗脱。每次分离所得的组分均留下一部分作肿瘤细胞增殖作用细胞生物学实验，选择具有抑制肿瘤细胞生长的组分作为以后分离提纯的目标。所得组分根据不同类物质特定性质，通过纸层析和薄层层析确定其所含有的物质种类。 一、　材料与试剂

1、白附子：由吉林省中医中药研究院提供，产地为河南省。 采集到的独角莲块茎切片，晾干，粉碎，粉碎度为10目。 2、茚三酮 分析纯 上海试剂厂 3、磷钼酸 分析纯 北京化工厂 4、甲基橙 分析纯 北京化工厂 5、吲哚醌 ISATIN 北京化工厂 6、羧甲基纤维素钠 分析纯 北京化工厂 7、硅胶G 薄层层析用 青岛海洋化工厂 8、硅胶H 薄层层析用 青岛海洋化工厂 9、G-25葡聚糖凝胶 上海生化所进口分装 10、层析滤纸 新华纸业有限公司

11、柱层析硅胶 60－100目 青岛海洋化工厂 实验过程中其它试剂均为分析纯。 二、主要仪器

1、搅拌器 郑州长城科工贸有限公司 2、旋转蒸发仪 上海医械专机厂 2FQ 85A

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3、循环水式多用真空泵 郑州长城仪器厂 4、台式高速离心机 TGL16G

5、电子天平 上海精密科学仪器有限公司 JA1003A 6、检测仪 LKB BROMMA 2138 7、记录仪 LKB BROMMA 2210 三、实验方法 1、提取流程图[47-61]

白附子粉末200g

加80%乙醇1000m，l400rpm搅拌8hr 静止，4000rpm离心15min 残渣 上清液（F组分） 加2%乙酸1000ml 减压蒸馏 400rpm搅拌8hr 静止4000rpm离心10min 浓缩物（至约20ml） 残渣 上清液(E组分) 合并，加10%NaOH调至pH5-6

用乙醚氯仿（1:1）萃取 萃取三次，每次300ml 分别合并上下层溶液

水相 有机相 碱化至pH8 用2%Na2CO3萃取

用氯仿300ml萃取

水相 有机相 水相 有机相

减压蒸馏 减压蒸馏 减压蒸馏 减压蒸馏 D组分 C组分 B组分 A组分

图4：提取流程图

称取白附子粉末200g，加入1000ml，80%乙醇400rpm搅拌提取8hr，

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静止，4000rpm离心10min，分别收集残渣和上清液。残渣加入1000ml2%乙酸，400rpm搅拌提取8hr，静止，4000rpm离心10min，去上清液减压蒸馏浓缩至约20ml，为E组分，取5ml作肿瘤细胞增殖实验，残渣弃去。乙醇提取离心后所得的上清液减压蒸馏浓缩至约20ml，为F组分，取5ml作细胞生物学实验，与乙酸提取的浓缩液合并，加入10%NaOH调pH5-6，用体积比为1：1的乙醚－氯仿溶液萃取三次，每次300ml混合液，分别合并上、下层溶剂，其中的水相用10%NaOH调pH值至8，用氯仿萃取，所得的酸性溶液减压蒸馏至约10ml，为D组分，有机相减压浓缩至约10ml，得C组分，其中的有机相用300ml 2%Na2CO3 萃取，所得的水相减压蒸馏至约10ml，得B组分，有机相浓缩至约10ml，得A组分。

每次从白附子粉末提取开始相同步骤所得的组分均合并，分别蒸干至固体，称重计算产率。做肿瘤细胞增殖实验，以确定对肿瘤细胞生长有抑制作用的组分，为下一步的分离纯化作指导。通过肿瘤细胞活性实验得E组分具有抑制肿瘤细胞生长的作用。所以下一步的分离纯化就针对E组分进行。

一共用白附子粉末３５５６ｇ，最后得到Ａ组分４７ｇ，Ｂ组分６８ｇ，Ｃ组分５２ｇ，Ｄ组分４９ｇ，Ｅ组分１７２ｇ，Ｆ组分１６８ｇ，产率分别为Ａ组分１．３２％，Ｂ组分１．９１％，Ｃ组分１．４６％，Ｄ组分１．３８％，Ｅ组分４．８４％，Ｆ组分４．７２％。　

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2、分离纯化流程

乙酸提取物 (E组分)

调至pH6-7 4000rpm离心10min

上清液（E2组分） 沉淀（E1组分）

减压蒸馏 反调pH至溶解

G－25葡聚糖凝胶

浓缩物 H2O洗脱 硅胶柱 E1Ⅰ组分　　　Ｅ１Ⅱ组分　　　Ｅ１Ⅲ组分

95%乙醇洗脱 丙酮：水（1:1）洗脱 5%HCl洗脱

洗脱液 洗脱液 洗脱液

减压蒸馏 减压蒸馏 减压蒸馏

E2Ⅰ组分　　　　　　　　　　　　Ｅ２Ⅱ组分　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｅ２Ⅲ组分　

图５：分离纯化流程图

取所有的E组分用10%NaOH调pH值至6-7，4000rpm离心10min，沉淀（E1）加酸水溶解，上葡聚糖凝胶G25柱，用蒸馏水洗脱，得三个峰，收集洗脱峰为E1Ⅰ组分，Ｅ１Ⅱ组分，Ｅ１Ⅲ组分，留作肿瘤细胞增殖影响实验。上清液（Ｅ２）减压蒸馏浓缩，之后上６０－１００目层析用硅胶柱（柱规格为直径３ｃｍ，长２７ｃｍ），分别用９５％乙醇、体积比为１：１的丙酮水溶液、５％ＨＣｌ溶液洗脱，所得洗脱峰均分别减压蒸馏至干，得E2

Ⅰ组分，Ｅ２Ⅱ组分，Ｅ２Ⅲ组分，作肿瘤细胞增殖影响实验，得E2Ⅰ组分

具有抑制肿瘤细胞生长的作用。　

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３、高压液相检测　３．１分析型高压液相检测　

柱型：Ｗａｔｅｒｓ　Ｐａｋ　１２５　　７．８　╳　３００ｍｍ，孔径１０ｕｍ　流动相　：０．２ｍｍｏｌＡＡＢ（醋酸钠＋醋酸）　仪器型号：日本岛津ＳＰＤ－１０Ａ　检测波长：２８０ｎｍ　

取E2Ⅰ组分，用超纯水溶解，上分析型液相，检测纯度。　３．２制备型高压液相检测　柱型：Ｗａｔｅｒｓ　Ｄｅｌｔａ　Ｐｒｅｐ０００　

流动相　：０．２ｍｍｏｌＡＡＢ（醋酸钠＋醋酸）　仪器型号：日本岛津ＳＰＤ－１０Ａ　检测波长：２８０ｎｍ　

取E2Ⅰ组分，用超纯水溶解至浓度约为１０ｍｇ／ｍｌ，上制备型液相，上样量为５００ｍｌ，收集主峰。主峰用相同条件上分析型液相，检测纯度。　４、性质检定［４８－５９］　

性质检定采用纸层析和薄层层析，根据中草药中几大类物质的特征反应来检定所得各组分所含物质的种类。 4.1纸色谱法鉴定

纸色谱法系以纸为载体，以纸上所含水分或其他物质为固定相，用展开剂进行展开的分配色谱。供试品经展开后，可用比移值（Rf）表示其各个组分的位置（比移值＝原点中心至斑点中心的距离/原点中心至展开剂前沿的距离），但由于影响比移值的因素很多，因而一般采用在相同实验条件下与对照物质对比以确定其异同。

取20×20cm新华滤纸，在距离底边2cm处用铅笔轻轻划线，点样于线上，点样量约50ug左右。待样品点晾干后放入装有展层液的层析

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缸内平衡30min，平衡后在展层系统中进行展层，展层与平衡的溶剂系统要一致，当溶剂前沿距滤纸上沿1-2cm时，取出滤纸，表出前沿的位置，待滤纸晾干后，用特定的显色剂显色。 4.1.1蛋白质、多肽类物质检定

酸性展层系统：正丁醇：80%甲酸：水＝15：3：2（体积比） 显色剂：0.1％茚三酮丙酮溶剂，0.1mg茚三酮加入100ml丙酮中 样品: 乙酸提取物（E组分），乙醇提取物（F组分），A组分, B组分, C组分, D组分

在酸性展层系统中展层，之后拿出滤纸，晾干，用0.1％茚三酮丙酮溶剂在纸的一面喷雾，干燥后放在110℃烘箱内烘5min，用铅笔画出斑点的位置。含有氨基酸、多肽和蛋白质的斑点显蓝色。 4.1.2荧光类物质鉴定

酸性展层系统：正丁醇：80%甲酸：水＝15：3：2（体积比） 样品：乙酸提取物（E组分），乙醇提取物（F组分），A组分, B组分, C组分, D组分

滤纸晾干后用紫外灯照射，用铅笔画出斑点的位置。 4.1.3皂甙类物质鉴定

展层液：氯仿：甲醇：乙酸乙酯：水＝4：8：1：1（体积比） 显色剂：称取磷钼酸1.25g加入50ml无水乙醇中，溶解后得草绿色2.5％磷钼酸显色剂。

样品：乙酸提取物（E组分），乙醇提取物（F组分），A组分, B组分, C组分, D组分

滤纸晾干后，喷显色剂，140℃加热５－１０ｍｉｎ，皂甙元均呈深蓝色。　４．１．４酸性物质鉴定　

展层液：氯仿：甲醇：乙酸乙酯：水＝4：12：1：1（体积比）

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显色剂：称取0.1g甲基橙加入10ml蒸馏水中，配成1.0％的甲基橙水溶液。

样品：乙酸提取物（E组分），乙醇提取物（F组分），A组分, B组分, C组分, D组分

滤纸晾干后，室温喷显色剂。 4.1.5生物碱类鉴定

展层液：氯仿：甲醇：乙酸乙酯：水＝4：12：1：1（体积比） 显色剂：碘1g和碘化钾10g溶于50ml蒸馏水中，加热，加冰醋酸2ml，用水稀释到100ml。

样品：乙酸提取物，乙醇提取物，A组分, B组分, C组分, D组分 滤纸晾干后，室温喷显色剂。 4.1.6强心甙类鉴定

展层液：氯仿：甲醇：乙酸乙酯：水＝4：12：1：1（体积比） 显色剂：25%三氯乙酸的乙醇溶液。

样品：乙酸提取物（E组分），乙醇提取物（F组分），A组分,B组分,C组分,D组分

滤纸晾干后，喷显色剂，110℃加热７－１０ｍｉｎ，紫外灯下观察。　４．１．７黄酮类物质鉴定　

展层液：氯仿：甲醇：乙酸乙酯：水＝4：12：1：1（体积比）　显色剂：１％－２％的ＦｅＣｌ３乙醇溶液　

样品：乙酸提取物（E组分），乙醇提取物（F组分），A组分, B组分, C组分, D组分　

滤纸晾干后，室温喷显色剂　４．１．８游离氨基酸鉴定　

酸性展层系统：正丁醇：80%甲酸：水＝15：3：2（体积比）

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碱性展层系统：正丁醇：12%氨水：95%乙醇＝13：3：3（体积比） 显色剂：1g吲哚醌溶于100ml无水乙醇中，再加10ml冰醋酸。 底色褪色剂：200ml 10%的Na2CO3溶液加入60g硅胶钠（Na2SiO2·9H2O），在60-70℃水浴上加热，至完全溶解。

样品：乙酸提取物（E组分），乙醇提取物（F组分）及其水解后产物 样品处理：取样品1mg左右，放入水解管内，在水解管内加入1ml 6mol/l的HCl，然后封管，放入105℃烘箱中保温20ｈｒ，打开水解管，把水解液放入５ｍｌ烧杯中，于１００℃水浴上蒸干，然后加几滴蒸馏水，再调ｐＨ６．０，蒸干，之后点样于20×20cm新华滤纸上，作酸碱双向层析。 待滤纸晾干后，均匀地喷上吲哚醌显色剂，注意不要使显色剂发生流淌现象，然后马上将滤纸放入8０℃烘箱内烘５－１５ｍｉｎ，使之完全显色，立即可以看到黄色底上的五彩宾缤纷的氨基酸斑点，马上放入褪色剂中，当黄色基本褪净后马上烘干，与标准图谱对照检出氨基酸。　4.1.9酸类物质鉴定

显色剂：银的氨溶液，0.1mol/L AgNO3的加入等量的5mol/L NH3·H2O

样品：乙酸提取物（E组分），乙醇提取物（F组分），A组分,B组分,C组分,D组分

样品分别点在滤纸上，未经展层，直接喷显色剂。 4.1.10糖类物质鉴定

显色剂：AgNO3的饱和水溶液0.1ml中加入20ml丙酮稀释，并滴加蒸馏水，随时振摇至沉淀出的AgNO3又复溶解为止，喷于滤纸上，在空气中暴露干燥后再喷0.5mol/L的NaOH乙醇溶液。

样品：乙酸提取物（E组分），乙醇提取物（F组分），A组分, B组分, C组分, D组分

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4.2薄层色谱鉴定

薄层色谱法，系将适宜的固定相涂布于玻璃板上，成一均匀薄层。待点样、展开后，与适宜的对照物按照同法所得的色谱图对比，用以进行鉴别、杂质检查或含量测定的方法。

取10×20cm的玻璃板一块，洗净，烘干，放在水平台上。取1g硅胶H，放在小研钵中，加3.4ml 0.5%羧甲基纤维素钠（CMCNa）溶液（起粘合作用），加4-5滴95%乙醇（消除泡沫），研磨数分钟后，将研好的浆液倒在预先准备好的玻璃板上，用玻璃棒将浆液铺开，再将玻璃板拿起，稍加振动，使浆液分布均匀，放在水平台面上，待水分蒸发后，使用之前置105℃烘箱中，活化３０ｍｉｎ，薄层厚度约为０．２５ｍｍ。　4.2.1蛋白质、多肽类物质鉴定

酸性展层系统：正丁醇：80%甲酸：水＝15：3：2（体积比） 显色剂：0.1％茚三酮丙酮溶剂，0.1mg茚三酮加入100ml丙酮中 样品：乙酸提取物（E组分），乙醇提取物（F组分），A组分, B组分, C组分, D组分

在酸性展层系统中展层，之后拿出薄板，晾干，用0.1％茚三酮丙酮溶剂喷在薄板上，干燥后放在110℃烘箱内烘5min，用铅笔画出斑点的位置，并用硫酸纸描下图谱。 4.2.2荧光类物质鉴定

酸性展层系统：正丁醇：80%甲酸：水＝15：3：2（体积比） 样品：乙酸提取物（E组分），乙醇提取物（F组分），A组分,B组分,C组分,D组分

薄板晾干后用紫外灯照射，用铅笔画出斑点的位置，并用硫酸纸描出斑点的位置。

4.2.3皂甙类物质鉴定

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展层液：氯仿：甲醇：乙酸乙酯：水＝4：8：1：1（体积比） 显色剂：称取磷钼酸1.25g加入50ml无水乙醇中，溶解后得草绿色2.5％磷钼酸显色剂。

样品：乙酸提取物，乙醇提取物，A组分,B组分,C组分,D组分 薄板晾干后，喷显色剂1，140℃加热５－１０ｍｉｎ，皂甙元均呈深蓝色。用铅笔画出斑点的位置，并用硫酸纸描出斑点的位置。　４．２．４酸性物质鉴定　

展层液：氯仿：甲醇：乙酸乙酯：水＝4：12：1：1（体积比） 显色剂：称取0.1g甲基橙加入10ml蒸馏水中，配成1.0％的甲基橙水溶液。

样品：乙酸提取物（E组分），乙醇提取物（F组分），A组分, B组分, C组分, D组分

薄板晾干后，室温喷显色剂。 4.2.5生物碱类物质鉴定

展层液：氯仿：甲醇：乙酸乙酯：水＝4：12：1：1（体积比） 显色剂：碘1g和碘化钾10g溶于50ml蒸馏水中，加热，加冰醋酸2ml，用水稀释到100ml。

样品：乙酸提取物（E组分），乙醇提取物（F组分），A组分,B组分,C组分,D组分

薄板晾干后，室温喷显色剂。 4.2.6强心甙类

展层液：氯仿：甲醇：乙酸乙酯：水＝4：12：1：1（体积比） 显色剂：25%三氯乙酸的乙醇溶液。

样品：乙酸提取物（E组分），乙醇提取物（F组分），A组分,B组分,C组分,D组分

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薄板晾干后，喷显色剂，110℃加热７－１０ｍｉｎ，紫外灯下观察。　４．２．７黄酮类物质鉴定　

展层液：氯仿：甲醇：乙酸乙酯：水＝4：12：1：1（体积比）　显色剂：１％－２％的ＦｅＣｌ３乙醇溶液　

样品：乙酸提取物（E组分），乙醇提取物（F组分），A组分,B组分,C组分,D组分　

薄板晾干后，室温喷显色剂。　

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第二部分 抗肿瘤活性测定

一、　材料与试剂

1、Eagle’s MEM培养基(Gibco，USA)：9.6g Eagle’s MEM加三蒸水100ml溶解，抽滤灭菌，4℃保存

2、胰蛋白酶(Gibco，USA)：浓度为0.25%，由pH7.4无Ca2+，Mg2+的D-Hank’s配制，0.2μm微孔滤膜抽滤灭菌，分装小青霉素瓶5ml/瓶，-20℃保存

3、胎牛血清(FCS，中国医学科学院血液研究所，批号200004)：20%FCS的Eagle’s MEM培养也用于常规细胞培养

4、碳酸氢钠(NaHCO3)：5.6% NaHCO3 溶液用于调节培养液的pH在7.2-7.4之间

5、A－549人肺癌细胞系：由大连市中医研究所保存 6、SMMC－7721人肝癌细胞系：由大连市中医研究所保存 7、K－562人白血病细胞株：购自武汉大学菌种保藏中心

8、接种S－180肿瘤小鼠：由吉林省中医中医研究院动物中心提供 9、CO2培养箱：SANYO，MCO-175M，Japan 10、倒置显微镜：Olympus，CK40-F200，Japan 11、超净工作台：CJ-1，苏州长桥净化设备厂 12、自动酶标光度计：EC-128C，美国 13、超纯水系统：Milli-Q，Millipore 14、24孔/96孔培养板：Costar，USA 二、实验方法[62-65]

1、 样品对A－549细胞系增殖影响的实验

复苏人肺癌A－549细胞系制成细胞悬液，接种在96孔细胞培养板上，每孔接种100μl细胞悬液，细胞约为0.5╳104/孔。加入适当浓度

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的受试药品20μl /孔，每组4孔，置于含 5%CO2，37℃饱和湿度的培养箱中孵育48小时。作用结束前4小时加入MTT溶液(1mg/ml)20μl，继续培养四小时。作用结束后吸弃培养液，加入100%二甲基亚砜100μl，经微量混合振荡器混合振荡10分钟后，经酶标仪测定各孔光密度值(OD值)。λ测量=550nm， λ参比=620nm。数据经“t”显著性检验。 A、B、C、D、E、F样品用2倍浓缩培养液稀释，经过滤除菌备用。每个样品经1:2的比例稀释，分留给剂量组，每组4个平行样品，对照加入不含样品的等量培养液。将细胞悬液接种在96孔培养板中，接种细胞，按照实验分组加入不同剂量的样品，继续孵育72hr，终止培养，测定观察指标。终止培养的细胞每孔加入MTT(1mg/ml)溶液20μl继续孵育4hr，终止反应，吸弃每孔的培养液，加入100%二甲基亚砜100ul，微量振荡器振荡5min，自动酶标仪测定各孔光密度值(OD值)。λ测量=550nm， λ参考=620nm。数据经“t”显著性检验。 2、 样品对SMMC－7721细胞系增殖影响的实验

复苏人肝癌SMMC-7721细胞系和人白血病K-562细胞系制成细胞悬液。E1, E1Ⅰ，Ｅ１Ⅱ，Ｅ２，Ｅ２Ⅰ，Ｅ２Ⅱ组分用2倍浓缩培养液稀释，经过滤除菌备用。其余部分与上面的实验相同。 3、样品对K562细胞系增殖影响的实验

复苏人白血病K562细胞系制成细胞悬液，接种在96孔细胞培养板上，制成细胞悬液。Ｅ２Ⅰ，Ｅ２Ⅱ，　Ｅ１Ⅰ，Ｅ１Ⅱ组分用2倍浓缩培养液稀释，经过滤除菌备用。其余实验与上面相同。 4、动物实验

选择接种S－180肿瘤10天小鼠，消毒操作部位皮肤，抽吸腹腔液，用生理盐水1:1稀释，每只小鼠右前腋窝皮下注射0.1ml样品，接种48hr后随即分组，每组10只，分别灌胃给E2组分，0.15ml/10g体重，每日

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一次，连续7天，停药次日处死动物，称体重解剖皮下瘤块称重，计算肿瘤抑制率。

从眼眶取血，10000rpm离心10min，上清保留。下层的血细胞放入冰箱冷冻室内，反复冻融几次，冷冻过夜，融化，10000rpm离心10min，保留上清。取小鼠肝脏，每个均标号称重剪碎，每个加入2ml 0.9％NaCl，匀浆，冷冻过夜，次日融化，10000rpm离心10min，保留上清。保留的样品留作酶活力测定。

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第三部分 抗肿瘤机理研究

一、　材料于试剂

1、Tris 分析纯 北京化工厂 2、EDTANa2 分析纯 北京化工厂 3、邻苯三酚 分析纯 北京化工厂 4、过氧化氢 分析纯 北京化工厂 5、牛血清白蛋白 联星公司

6、高氯酸 分析纯 北京化工厂 7、镧 分析纯 北京化工厂 8、酵母RNA 联星公司 实验中其它试剂均为分析纯 二、实验方法[66] 1、SOD活力测定

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）催化自由基（ O2-）的歧化反应，是机体清除氧自由基的重要酶。SOD测定方法有许多中，我们选用的是邻苯三酚自氧化法。邻苯三酚在碱性条件下能发生自氧化，生成有色中间产物和氧自由基（ O2-），O2- 对自氧化起催化作用，SOD能清除氧自由基，从而抑制邻苯三酚自氧化，根据邻苯三酚自氧化速率的变化，推算出SOD活力。 1.1试剂和仪器 1） 2）

A液：pH8.2内含有1mmolEDTANa2的0.1molTris－HCl缓冲液 B液：含有3mmol/L邻苯三酚的10mmol/L 的HCl溶液

1.2测定方法 1）

空白：在25℃，２ｍｌ蒸馏水加２．３５ｍｌＡ液，０．１５ｍｌＢ液，混合均

匀，记时，测定３２５ｎｍ处ＯＤ值变化，测定自氧化速度，ΔＯＤ３２５（ｍｉｎ－１）；　

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2） 样品：在25℃，２ｍｌ蒸馏水加２．３５ｍｌＡ液，０．１５ｍｌＢ液，再加入

５－２５ｕｌ样品，混合均匀，记时，测定３２５ｎｍ处ＯＤ值变化，ΔＯＤ’３２５（ｍｉｎ

－１

）

１．３、计算：

活力（Ｕ／ｍｇ）＝［ΔＯＤ３２５（ｍｉｎ－１）－ＯＤ’３２５（ｍｉｎ－１）］╳２╳Ｋ╳Ｄ／［ＯＤ’３２５（ｍｉｎ－１）　╳Ｖ］　

其中　　Ｖ：样品体积（ｍｌ）　　　　　　　Ｄ：样品稀释倍数　

　　　　　　Ｋ：反应动力学常数（本实验条件下为４．５）　２、过氧化物酶活力测定　

　　　　过氧化物酶催化过氧化氢的还原反应，这时用邻苯三酚作氢供给体，它被氧化后所形成的产物具有在４５０ｎｍ处具有最大光吸收值，可以通过ＯＤ值的变化来测定过氧化物酶的浓度。定义一个过氧化物酶单位相当于在２０ｓ内于２０℃从邻苯三酚催化产生１ｍｇ　氧化产物时所需要的酶量。　２．１试剂　１）　

磷酸盐缓冲液（ｐＨ６．０）：取１．３６ｇ　　ＫＨ２ＰＯ４溶于８０ｍｌ蒸馏水中，

用１ｍｏｌ／ＬＮａＯＨ将ｐＨ值调至６．０，用蒸馏水定容至１０００ｍｌ。　２）　３）　

邻苯三酚溶液：取５００ｍｇ邻苯三酚溶于蒸馏水中，定容至１０ｍｌ　过氧化氢溶液：用蒸馏水稀释１．６７ｍｌ过氧化氢（３０％过氧化氢）

至１００ｍｌ　２．２操作步骤　

取０．３２ｍｌ磷酸盐缓冲液，０．１６ｍｌ过氧化氢溶液，０．３２ｍｌ邻苯三酚溶液和２．１０ｍｌ蒸馏水加入１ｃｍ比色杯中，混合，调节至２０℃。加入０．１０ｍｌ样品液，再次混合，记时，于４２０ｎｍ处以空白值为参比测定吸光度，每次隔２０ｓ，直至每２０ｓ内的吸光度增大值达到稳定为止。空白的测定方

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法与主值相同，只是不加样品，而是加等量磷酸盐缓冲液。　２．３、计算　

　　活力（Ｕ／ｍｇ）＝Ｅ４２０　╳　３　／（Ｅｗ　╳　１２）　其中：Ｅ４２０　：４２０ｎｍ处吸光度值　

３、１２：换算系数　

Ｅｗ：１ｍｌ所用的样品液中含有的样品的重量（ｍｇ）　３、核糖核酸酶（ＲＮ　ａｓｅ）活力测定　

核糖核酸酶水解核糖核酸生成酸溶的低聚核苷酸盐。这一反应决定了２６０ｎｍ处吸光度增大值的大小，可以用分光光度计测定此增大值。定义一个核糖核酸酶单位相当于在３７°Ｃ，ｐＨ５．０、波长为２６０ｎｍ的条件下使吸光度值增大１．０时所需的酶量。　３．１　试剂　

１）醋酸盐缓冲液（ｐＨ５．０）：取０．８２ｇ醋酸钠溶于７０ｍｌ蒸馏水，用醋酸调ｐＨ值至５．０，并定容至１０００ｍｌ。　

２）指示剂溶液：用蒸馏水稀释２７．２ｍｌ　６０％的高氯酸和０．７５ｇ镧至１００ｍｌ　

３）底物溶液：取０．５０ｇ酵母核糖核酸溶于醋酸盐缓冲液中，并定容至１００ｍｌ　３．２操作步骤　

　　　　　取１．０ｍｌ酶溶液滴入一只离心管中，调温至３７℃，添加１．０ｍｌ已经预热至３７℃的底物溶液，摇动同时记时。于３７℃精确保温４ｍｉｎ后添加１．０ｍｌ指示剂溶液，使反应终止。放入冰浴中冷却５ｍｉｎ后用离心机分离此反应混合物（３５００ｒｐｍ离心１０ｍｉｎ）。取０．１０ｍｌ上清液，用３．０ｍｌ蒸馏水稀释，以空白值为参比测定２６０ｎｍ处吸光度值。　３．３计算　

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活力（Ｕ／ｍｌ）＝Ｅ２６０　╳　３０　／　Ｅｗ　其中：Ｅ２６０：２６０ｎｍ处的吸光度值　

３０：换算系数（从３．０ｍｌ保温溶液中取出０．１ｍｌ）　Ｅｗ：１ｍｌ所用的样品液中含有的样品的重量（ｍｇ）　

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第四部分　　结构分析　

一、　仪器：　

１、核磁共振谱仪　　　　　　德国布鲁克公司ＡＶＡＮＣＥ５００　２、红外分光光度计　　　　Ｉｍｐａｃｔ１２０　３、紫外分光光度计　　　　λ２０　二、方法［６７－７５］　

１、　红外光谱：取约１ｍｇ样品Ｘ粉末，混入约１００倍的溴化钾于研钵中，研磨至混匀，在红外等下烘干，打片，在红外分光光度计上，扫描波长从３００ｎｍ至４０００ｎｍ。　

２、　紫外光谱：取约１ｍｇ样品Ｘ粉末，加入压好的硫酸钡片上，严实，放入固体紫外分光扫描仪中，扫描波长为从２００ｎｍ至８００ｎｍ。　

３、　核磁光谱：取约１０ｍｇ样品Ｘ粉末，用ＣＤＣｌ３溶解，加入核磁管内，放在液氮罐内，扫描。　

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结　　果　

１、　

Ｅ２组分硅胶柱纯化　

图６：Ｅ２组分硅胶柱洗脱图谱　

取Ｅ２组分，加一定量柱层析用硅胶，于８０°Ｃ烘箱内烘干，作为样品胶，装柱，柱规格为Φ３ｃｍ，长２７ｃｍ，分别用９５％乙醇，丙酮水（１：１）溶液，５％ＨＣｌ溶液洗脱，用示差检测器检测，得峰１、峰２、峰３，分别为Ｅ２Ⅰ组分、Ｅ２Ⅱ组分、Ｅ３Ⅲ组分。　２、　

Ｅ１组分Ｇ－２５柱纯化　

图７：Ｅ１组分Ｇ２５柱洗脱图谱　

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取Ｅ１组分加酸水溶液，上葡聚糖凝胶Ｇ－２５柱，用蒸馏水洗脱，２８０ｎｍ检测，得洗脱峰１、峰２、峰３，分别为Ｅ１Ⅰ组分、Ｅ１Ⅱ组分、Ｅ１Ⅲ组分。洗脱体积分别为７８ｍｌ、１４２ｍｌ、１６３ｍｌ。　3、纸层析蛋白质、多肽类物质鉴定

图8：A、B、C、D组分蛋白质、多肽类物质鉴定图

图9：E、F组分蛋白质、多肽类物质鉴定图

由上面的图谱可以看出，乙酸提取物，乙醇提取物，B组分,C组分,D组分中含有蛋白质、多肽类物质，A组分中没有蛋白质、多肽类物质。

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4、纸层析荧光类物质鉴定

图10：A、B、C、D组分荧光类物质鉴定图

图11：E、F组分荧光类物质鉴定图

由图谱可以看出来，这六个样品中均含有对紫外有吸收的物质，但它们在紫外下所显的颜色不同。

５、纸层析皂甙类物质鉴定　

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图１２：Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ组分皂甙类物质鉴定图　

由上面的图谱可以看出来，乙酸提取物中不含皂甙类物质，乙醇提取物，A组分, B组分, C组分, D组分均含有皂甙类物质。 6、纸层析酸类物质鉴定

图13：A、B、C、D、E、F组分酸类物质鉴定图

由上面的图谱可以得出，乙酸提取物中可能含有酸性物质，乙醇提取物，A组分,B组分,C组分,D组分中无酸性物质。 ７、纸层析生物碱类鉴定

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图14：A、B、C、D、E、F组分生物碱类物质鉴定图

由上面的图谱可以得出，只有A组分和F组分中含有生物碱类物质，其余的样品中没有此类物质。 ８、纸层析强心甙类物质鉴定　

图１５：Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ组分强心甙类物质鉴定图　

可以看出来，上面的六个样品中均不含有强心甙类物质。　９、纸层析黄酮类物质鉴定　

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图１６：Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ组分黄酮类物质鉴定图　

得到乙醇提取物和D组分中含有黄酮类物质，乙酸提取物，A组分,B组分和C组分中没有黄酮类物质。　１０、纸层析游离氨基酸鉴定

图17：乙酸提取物水解后氨基酸图

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图18：乙酸提取物水解前氨基酸

图19：乙醇提取物水解后氨基酸图

图20：乙醇提取物水解前氨基酸图

通过水解前后的图谱对比可以看出来，乙酸提取物和乙醇提取物中均含

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有游离氨基酸。

１１、纸层析酸类物质鉴定

图21：A、B、C、D、E、F组分酸类物质鉴定图

可以得出，乙醇提取物，B组分,C组分中含有酸类物质，而乙酸提取物，A组分, D组分中不含有酸类物质。 １２、纸层析糖类物质鉴定

图21：A、B、C、D、E、F组分糖类物质鉴定图

可以看出，乙酸提取物和D组分中含有糖类物质，乙醇提取物，A组分,B组分,C组分中没有糖类物质。 １３、薄层层析蛋白质、多肽鉴定

图23：A、B、C、D组分蛋白质、多肽类物质鉴定图