校准及及其注意事项 (1)

校准及其注意事项

在生化（终点法，速率法等）、免疫（比浊，荧光及发光法等）、血液及分子诊断（荧光，发光法等）分析中，均涉及校准，如何有效选择或设计校准个数、浓度及校准类型会直接影响到分析结果的可靠性。下面我们对校准品基质、校准使用个数、校准品浓度及校准类型相关信息做些简单的分享。

序号 事项 选择原则

理想的校准品基质应当与被分析物基质一致或类同，尤其是在临床血液样品或体液样品分析中。理论上讲越高级的方法或检测系统，基质相应越小，但实际商品试剂（包括校准品、质控品和试剂），既使选定是参考方法或参考检测系统，由于考虑商品试剂的货架寿命及消除来源于血清基质的干扰，少不了会有诸多添加剂的加入及主要成分浓度调整，造成原有的参考方法本身基质及浓度发生改变，这样必然造成以临床样品为基准，试剂本身表露出固有基质效应（基质偏差），同时不同分析仪器系统相比样品而言也存在基质效应(包括随机和系统性的偏差)。

目前绝大部分临床分析项目均缺乏对应的参考方法，参考物及参考测量系统，这方面在免疫及分子诊断分析中表现极为明显。这对制造商建立厂家工作测量系统和临床常规分析系统增加了不少难度，对于这类方法，如何有效提高临床样品分析的准确度就是制造商的“金标准”。在实际的研究中我们发现纯物质与含基质的纯物质在同一反应中会存在差异，基质效应解决得越好的商品试剂，这种差异会越小；在免疫分析中，使用单抗、多抗及使用不同来源单抗、多抗在同一试剂基质中表观反应会有明显差异，这就要求我们必须以被分析物基质作为我们校准品基质，以减小试剂、仪器或样品的未知基质干扰。理想的校准基质是含被分析物的新不含任何添加剂或已知添加剂不确定度的新鲜血液或体液，但实际商品基本不可能做到这一点。但在方

1 校准品基质

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法学研究或质量监测中不难做到。

理论上讲，被分析物新鲜血清样品在不同分析系统上测定值应基本一致，但实际的工作中这种差异早些年非常巨大，近些年由于临床溯源工作的发展及实验室质量管理品质的提升，这种差异逐年缩小，一些有参考测量系统的商品试剂一致性也越来越好，人们也开始越来越关注商品的抗基质效应能力（传统也叫抗干扰能力）。所以系统化，强调的不单是配套性，还有解决一致性。

一些学者，在考虑解决临床样品分析中一致性问题，曾提出使用“临床血清盘”的概念，但由于新鲜血清自身的不稳定性及配套分析用商品本身的不确定性，加上国内缺乏健全的参考实验系统，致使这种工作难于展开，但作为一种有效合理的质量控制模式，目前已越来越被商品生产厂商所重视，尤其是大型试剂生产厂家，目前官方也已明确要求商品开发应进行临床验证试验，尤其是三类试剂。所以重视临床样品分析，间接也要求重视广义的基质效应（包括样品、校准品、质控品、试剂及仪器等等）。

根据以往经验，校准品基质越接近被分析物基质，其赋值（并不能代表量值）在系统间互通性越强，当然这个前提是试剂本身的基质效应较小。理论上讲，不同系统所使用的校准品定值会有差异，但实际国内许多企业校准品都是某一系统的赋值代表所有系统的赋值，这本身是不合理的（但实际工作中有时又不得不这样做），除非充分考虑了基质效应且使用的是高级别的参考测量系统（单个实验室量值本身存在局限性）进行量值。

很多时候我们会困扰校准品使用个数及浓度；关于商品校准如何量值，在以后的篇幅中我们再做探讨。但无论怎样，母代校准品（厂家工作校准品）的量值在观念上要有多系统和多中心量值的才可靠，它更多类同于“血清盘”，但它本身无法代表“血清盘或样品盘”。

在临床分析中“单点校准”作校准是有条件的，如果制造商有关方法稳

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校准品个数及浓度

定性文件或者厂家工作测量系统的评价中，已经证明某项目性能特点之一的校准曲线是线性关系，而且b值几乎为“0”（通过原点），即Cu=a*K*Au或Cu=A*K*△Au/min,可以用“单点校准（一点定标）”。如果项目虽属线性，但通过线性验证b值不等于“0”（不通过原点），既有斜率变化，也存在截距，应使用两个以上校准液，如Olympus仪器或贝克曼仪器，前者属于AB,而后者属于AA类型。

对于校准曲线是非线性的，必需使用3个以上校准液，每个校准液都要

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Guangzhou ZYCDNA science technology Co., LTD 有一个合适的浓度，万不可采用单点校准。 ① Logit(4P)校准模式（四参数对数）：这种模式通常指的是以浓度的对数为横坐标，吸光度或吸光度变化值为纵坐标，其校准数学方程式为： A=A0+K1 有四个参数A0，K，a和b，要求提供至1exp[(abInC]少4个校准品（通常也支持使用4个以上校准品），其中第一个校准品的浓度（活性）为“0”，其对应的A就等于A0，用最速下降法+拟牛顿法求解。该模式适用于随着浓度的增加，其吸光度增加越来越小的校准曲线。在ELISA法和部分免疫比浊法中使用较为普遍。 ② Logit(5P)校准模式（五参数对数）：这种模式通常指的基本也是以浓度的对数为横坐标，吸光度或吸光度变化值为纵坐标，其校准数学方程式为： A=A0+K3 非线性校准 1 有四个参数A0，K，a，b和c，要1exp[(abInCcC]求提供至少5个校准品（通常也支持使用5个以上校准品），其中第一个校准品的浓度（活性）为“0”，其对应的A就等于A0，用最速下降法+拟牛顿法求解。该模式适用于随着浓度的增加，其吸光度增加越来越小的校准曲线，与Logit(4P)相比，曲线拟合程度更高。可用在ELISA法和部分免疫比浊法中使用。 ③ Exponential 5P校准模式（指数函数），其校准数学方程式为： A=A0+Kexp[aInc+b(Inc)2+c(InC)3] 有五个参数A0，K，a，b和c，要求提供至少5个校准品（通常也支持使用5个以上校准品），其中第一个校准品的浓度（活性）为“0”，其对应的A就等于A0，用最速下降法+拟牛顿法求解。该模式适用于随着浓度的增加，其吸光度增加越来越大的校准曲线。 ④ Polynpmial 5P校准模式（多项式5），其校准数学方程式为： InC=a+b(AA0AA02AA03)+c()+d() 有五个参数A0，a ，100100100b，c和d，要求提供至少5个校准品（通常也支持使用5个以上校准- 3 -

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品），其中第一个校准品的浓度（活性）为“0”，其对应的A就等于A0，用最速下降法+拟牛顿法求解。

⑤ Spline校准模式（样条函数），其校准数学方程式为：

C-Ci=R0i+ai（C-Ci）+bi（C-Ci）2+ci（C-Ci)3-R 有4个参数R0i，ai，bi和ci，要求提供至少2-6个校准品，其中第一个校准品的浓度（活

性）为“0”，其对应的A就等于A0，用最速下降法+拟牛顿法求解。由于是分段拟合，其拟合程度在所有校准类型中最高。不少免疫比浊项目均可采用此种模式。

生化检测系统校准验证的目的是通过一系列已知浓度的校准验证材料对其测定值的回归，验证分析项目在线性范围内结果是否准确，以反映目前检测系统的校准是否正确及稳定。它是将测定结果与同组测定均值比较，理想的系统校准验证状态是实验室校准验证材料测定结果与同组均值绘图为一条斜率=1，截距=0的直线。当实验室的测定结果与同组比较，其测定值

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校准验证

在可接受范围内的标准有效。

因此，校准是实验室质量控制中一个重要环节，而校准验证是验证检测系统校准是否有效的重要保证。

校准验证具体可参照美国病理协会（CAP）使用的CAP设备委员会（IRC）法，该法对线性评价结果共分线性1、线性2、非线性和不精密4种。

① 抗原抗体比例：抗原抗体复合物微粒的大小与抗原抗体的比例是浊度形

成的关键因素，抗原抗体必需比列适当才能出现最高的结合率，既无抗原过剩，也无抗体过剩，此时抗原抗体符合物的结合与解离达到平衡。当抗原过剩时，由于钩状效应，形成的抗原抗体复合物小，易发生解离，导致浊度下降。而当反应体系中抗体过量时，抗原抗体复合物的形成量

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免疫比浊法的主要影响因素

随抗原的增加而增加，因此免疫比浊测定的基本原则是反应体系中始终保持抗体量过剩，以保证抗原抗体复合物的形成量变化与浊度变化一致。但抗体量要求适量，以避免由于抗体过度过量而导致后带现象。 ② 胶乳的粒径：在胶乳增强免疫比浊法分析中，胶乳的粒径大小直接影响

到反应的灵敏度和检测范围，通常大颗粒有利于增加反应的灵敏度，小颗粒有利于提高检测范围，但这与胶乳颗粒本身结合抗原或抗体量有关系。在大多数胶乳增强免疫比浊分析中，胶乳的粒径一般控制在100-300纳米，粒径的选择一般与所采用的入射波长及分析物分子量大小及抗体

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类型有关系。

③ 伪浊度：反应体系中，除了待测抗原与抗体特异性结合形成的免疫复合

物产生的浊度为免疫比浊监测的对象，除此之外，其它可引起的非特异性浊度均称为伪浊度。形成伪浊度的原因包含标本因素，如嗜异性抗体、自身抗体、冷凝素、脂血、黄疸、溶血、混浊、血细胞混入及反复冻融。试剂因素：抗体效价过低或抗原不纯、含交叉反应性抗体、试剂污染、试剂中增浊剂过高（如3.5%的PEG可沉淀抗原抗体复合物，也可使IgM、2巨球蛋白、脂蛋白等沉淀，12%PEG可使IgG发生沉淀，20%以上的PEG可使白蛋白发生沉淀）、试剂的pH不恰当、离子强度太高或不适宜的离子引入、抗体的不同类型或来源均有可能导致伪浊度的产生。一般来说，免疫比浊分析中推荐使用R型抗体，而H型抗体亲和力弱。 ④ 批间差最有可能的来源：主要是抗原及抗体纯度、抗体亲和力、校准品

和配套质控品基质效应、针对样品的试剂及仪器基质效应、试剂针对样品的样品基质效应（基质干扰）、交联剂及交联时间和温度、胶乳微球粒径均一性和胶乳表面功能基团、胶乳造成的空间位阻效应、封闭剂的用量及类型、抗原或抗体包被量等。

资料整理：赵瑜

2016年5月20日

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