生物技术通报
・研究报告・ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹＢＵＬＬＥＴＩＮ
２００８年第４期一种高效可直接用于ＰＣＲ扩增的不吸水链霉菌
基因组ＤＮＡ的提取方法
吴红艳
摘
要：
陈飞桓明辉关艳丽郭玲玲
（辽宁省微生物科学研究院，沈阳１２２０００）
通过对提取不吸水链霉菌基因组ＤＮＡ的冻融法、微波法和溶菌酶破壁法等几种方法进行对比、分析，得
出结论：溶菌酶破壁法所提取的不吸水链霉菌基因组ＤＮＡ可直接用于ＰＣＲ扩增。这为今后不吸水链霉菌相关基因的实验研究提供了可靠的理论依据。
关键词：
不吸水链霉菌
基因组ＤＮＡ
提取
ＰＣＲ扩增
ＡＨｉ－ＥｆｆｅｃｔＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＭｅｔｈｏｄＵｓｅｄＤｉｒｅｃｔｌｙｆｏｒＰＣＲｔｏ
ＧｅｎｏｍｅＤＮＡｏｆＳｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓＡｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ
ＷｕＨｏｎｇｙａｎ
ＣｈｅｎＦｅｉＨｕａｎＭｉｎｇｈｕｉＧｕａｎＹａｎｌｉＧｕｏＬｉｎｇｌｉｎｇ
（ＬｉａｏｎｉｎｇＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＡｃａｄｅｍｙｏｆＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｈｅｎｙａｎｇ１２２０００）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＴｈｅｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｏｆＧｅｎｏｍｅＤＮＡｏｆＳｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓＡｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓｗｅｒｅｃｏｍｐａｒｅｄａｎｄａｎａｌｙｚｅｄｔｈｒｏｕｇｈ
ｔｈｅｍｅｔｈｏｄｓｏｆｆｒｅｅｚｅ－ｔｈａｗ，ｍｉｃｒｏｗａｖｅａｎｄｂｒｅａｋ－ｓｈｅｌｌｏｆｌｙｓｏｚｙｍｅ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅＧｅｎｏｍｅＤＮＡｏｆＳｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓＡｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｔｈｒｏｕｇｈｔｈｅｍｅｔｈｏｄｏｆｔｈｅｂｒｅａｋ－ｓｈｅｌｌｏｆｌｙｓｏｚｙｍｅｃａｎｂｅｕｓｅｄｄｉｒｅｃｔｌｙｆｏｒＰＣＲ．ＴｈｅｓｔｕｄｙｇａｖｅａｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌｂａｓｉｓｆｏｒｔｈｅｆｕｔｕｒｅｌａｂｒｅｓｅａｒｃｈｏｎｒｅｌａｔｉｖｅｇｅｎｅｏｆＳｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓＡｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：
ＳｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓａｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓＧｅｎｏｍｅＤＮＡＥｘｔｒａｃｔｉｏｎ
ＰＣＲ
不吸水链霉菌是由辽宁省微生物科学研究院在广西梧州地区土样中分离得到一株不吸水链霉菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓａｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ），其经发酵产生的次生代谢产物为广谱抗真菌抗生素（命名为梧宁霉素），对多种植物病原菌具有较强的抑制和杀死作用，而且其毒性很低，具有广阔开发应用前景。但其一直存在着产量低、效价低、保存期短等问题，阻碍其广泛的推广应用，这就需要找到一种改善的方法。随着分子生物学技术的不断提高，克隆不吸水链霉菌次级代谢过程中的激活因子和限速酶基因，增加其在菌种次级代谢中的表达，要对目的基因进行表达，首要的任务就是基因组ＤＮＡ或ＲＮＡ的提取，然后进行ＰＣＲ扩增、ＰＣＲ产物经回收、纯化后与载体连接、转入宿主细胞中进行诱导表达以及表达产物相关指标的检测等，因而其基因组ＤＮＡ或ＲＮＡ的获得是前提条件。下面对于不吸水链霉菌基因组ＤＮＡ的提取方法进行了研究探讨。
１材料与方法
１．１材料
１．１．１菌种不吸水链霉菌菌种由辽宁省微生物科学研究院菌种中心提供。
裂解液、蛋白酶Ｋ、无水乙醇、苯酚、氯仿、异戊醇、异丙醇、亚精胺、１．１．２试剂ＴＥ缓冲液、ｐｖｐ、Ｔａｑ酶、
ｄＮＴＰ等。
水浴锅、电泳仪、１．１．３仪器高速冷冻离心机、ＰＣＲ仪等。
１．２方法
１．２．１不吸水链霉菌基因组ＤＮＡ提取。
收稿日期：２００８－０２－２６
作者简介：吴红艳（１９６７－），女，副研究员，研究方向：微生物及其分子生物学研究
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生物技术通报ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＢｕｌｌｅｔｉｎ
冻融法（一）提取基因组ＤＮＡ
２００８年第４期１．２．１．１（１）菌种发酵用灭菌的接种针将不吸水链霉菌菌接种于ＬＢ培养
液中，２８℃振荡培养２４ｈ，备用。（２）菌体裂解取发酵液于６０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，收集菌体，用ＴＥ缓冲液悬浮、洗涤，离心，收集菌体，加入ＴＥ缓冲液悬浮，再加入裂解液，混合均匀，再加入适宜浓度的蛋白酶Ｋ，混合均匀，于５５℃水浴５ｈ。（３）基因组ＤＮＡ的提取取菌体裂解液离心收集上清液，加入无水乙醇、苯酚：氯仿：异戊醇混合液抽提，收集上层液，抽提两次。按一定比例加入５ｍｏｌ／Ｌ氯化钠、异丙醇沉淀ＤＮＡ约
３０ｍｉｎ，离心收集沉淀。（４）基因组ＤＮＡ的纯化：步骤（３）中收集到的沉淀加入１０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ．Ｈｃｌ混匀，再加
入２．９ｍｍｏｌ／Ｌ亚精胺沉淀ＤＮＡ３０ｍｉｎ，离心，收集沉淀，加入１０ｍｍｏｌ／ＬＭｇｃｌ２，３００ｍｍｏｌ／ＬＮａｃｌ以及异丙醇进一步沉淀ＤＮＡ，离心，收集沉淀。（５）用７０％乙醇洗涤沉淀，离心，收集沉淀，挥干，将沉淀溶解于含ＲＮＡ酶的ＴＥ缓冲液中，３７℃水浴消化３０ｍｉｎ，－２０℃保存。
１．２．１．２冻融法（二）提取基因组ＤＮＡ
（１）菌种发酵：用灭菌的接种针将不吸水链霉菌菌接种于ＬＢ培养液中，
（１）———（３）与冻融法提取（一）相同，去掉步骤（４），进行步骤（５）即得。
１．２．１．３微波法提取基因组ＤＮＡ［１］
２８℃振荡培养２４ｈ，备用。（２）基因组ＤＮＡ的提取：取发酵液于６０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，收集菌体，加入洗涤
液洗涤，在旋涡混合器上振荡５ｓ，６０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，收集菌体，加入裂解液，振荡悬浮５ｓ，使溶液均匀，然后于功率为６００Ｗ微波炉中处理６０ｓ；加入６５℃预热的抽提液，振荡５ｓ；加入等体积的Ｔｒｉｓ－饱和酚／氯仿溶液抽提，１００００ｒ／ｍｉｎ离心，收集上清液，上清液以等体积的异丙醇沉淀ＤＮＡ，７０％乙醇洗涤沉淀，离心，收集沉淀，干燥后溶解于含ＲＮＡ酶的ＴＥ缓冲液中，３７℃水浴消化３０ｍｉｎ，－２０℃保存。
１．２．１．４溶菌酶破壁法提取基因组ＤＮＡ取培养３ｄ的发酵液，离心，收集茵体，用ＴＥＳ（３０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ－
ＨＣｌ，５ｍｍｏｌ／ＬＥＤ－ＴＡ，５０ｍｍｏｌ／ＬＮａＣ１，ｐＨ８．０）Ｂｕｆｆｅｒ洗涤菌体，再用５倍体积的含２０蔗糖的ＴＥＳＢｕｆｆｅｒ重
悬菌体并加入溶菌酶，３７℃温育２ｈ；离心收集沉淀，用含蔗糖的ＴＥＳＢｕｆｆｅｒ悬浮沉淀，加入ＥＤＴＡ，室温处理１０ｍｉｎ，再加入蛋白酶Ｋ，６０℃温育１ｈ；加０．８ｍｏｌ／Ｌ的ＮａＣ１和ＣＴＡＢ，６５℃温育１０ｍｉｎ；然后用氯仿／异戊醇（２４：１）抽提二次，０．６×体积异丙醇沉淀，收集沉淀，用７０％乙醇洗涤，挥干，用ＴＥ溶解，－２０℃保存。
１．２．２基因组ＤＮＡ琼脂糖凝胶电泳检测样品：（１）冻融法（一）提取基因组ＤＮＡ；（２）冻融法（二）提取的
基因组ＤＮＡ；（３）微波法提取的基因组ＤＮＡ；（４）溶菌酶破壁法提取的基因组ＤＮＡ；（５）为标准ＤＮＡ。琼脂糖凝胶浓度：０．８％电压：８０Ｖ电泳时间：３０ｍｉｎ。观察：２６０ｎｍ紫外灯观察照相。
１．２．３以提取的基因组ＤＮＡ做模板进行ＰＣＲ扩增经研究表明在不吸水链霉菌的代谢过程中会产生胆
固醇氧化酶，这种酶对鞘翅目、鳞翅目、双翅目、直翅目等害虫都有毒杀作用，对鞘翅目的棉铃虫象甲具有极强的毒杀能力，是产生梧宁霉素的限速酶之一，因而，克隆胆固醇氧化酶基因是提高不吸水链霉菌梧宁霉素效价的重要途径之一。
模板：（１）为冻融法（二）提取的基因组ＤＮＡ（２）、（３）、（５）为溶菌酶破壁法提取的基因组ＤＮＡ（４）为微波法提取的基因组ＤＮＡ
引物：利用相关的分子生物学软件，通过分析比较Ｇｅｎｅｂａｎｋ中已知的胆固醇氧化酶基因序列，获得胆固醇氧化酶基因保守序列信息，设计并合成一对简并引物，用来从不吸水链霉菌梧州新亚种基因组ＤＮＡ中扩增胆固醇氧化酶基因片段，简并引物序列［４］如下。
上游引物：
５＇－ＧＧＧＧＡＴＣＣＧＧＡＡＴＴＣＧＴＳＧＧＹＧＧＳＧＧＹＴＣＳＣＴＣ－３＇
下游引物：
５＇－ＣＣＧＡＡＴＴＣＣＧＧＧＡＴＣＣＧＣＴＣＢＧＣＢＷＧＭＧＣＳＧＹＧＡＴ－３＇
加入了ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ两个酶切位点。
反应条件：９５℃６０ｓ，９４℃３０ｓ，７１℃，３ｍｉｎ；３０个循环，并进行琼脂糖凝胶电泳检测。
２００８年第４期吴红艳等：一种高效可直接用于ＰＣＲ扩增的不吸水链霉菌基因组ＤＮＡ的提取方法
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１．２．４ＰＣＲ［２，３］扩增产物琼脂糖凝胶电泳检测样品：（１）模板为冻融法（二）提取的基因组ＤＮＡＰＣＲ扩增
产物（２）、（３）、（５）模板为溶菌酶破壁法提取的基因组ＤＮＡＰＣＲ扩增产物（４）模板为微波法提取的基因组
ＤＮＡＰＣＲ扩增产物（６）为标准ＤＮＡ（７）为阴性对照（８）为模板ＤＮＡ；琼脂糖凝胶浓度：０．８％电压：８０Ｖ电泳
时间：３０ｍｉｎ；观察：２６０ｎｍ紫外灯观察照相。
２结果与讨论
２．１结果
冻融法提取（二）、微波法快速提取放线菌基因２．１．１不吸水链霉菌基因组ＤＮＡ提取冻融法提取（一）、
组ＤＮＡ、溶菌酶破壁法提取基因组ＤＮＡ均得到白色沉淀。２．１．２基因组ＤＮＡ琼脂糖凝胶电泳检测（图１）。
２．１．３以提取的基因组ＤＮＡ做模板进行ＰＣＲ扩增及琼脂糖凝胶电泳检测（图２）。
图１基因组ＤＮＡ琼脂糖凝胶电泳检测结果
冻融法（一）提取的基因组ＤＮＡ２、冻融法（二）提取１、
的基因组ＤＮＡ３、微波破壁法提取的基因组ＤＮＡ４、溶菌酶破壁法提取的基因组ＤＮＡ５、标准ＤＡＮ样品
以提取的基因组ＤＮＡ为模板进行ＰＣＲ扩增后
琼脂糖凝胶电泳检测结果
模板为冻融法（二）提取的基因组ＤＮＡＰＣＲ扩增产物２、１、３、５、模板为溶菌酶破壁法提取的基因组ＤＮＡＰＣＲ扩增产物４、模板为微波法提取的基因组ＤＮＡＰＣＲ扩增产物６为标准ＤＮＡ７为阴性对照８为模板ＤＮＡ
图２
２．２讨论
不吸水链霉菌基因组ＤＮＡ提取经琼脂糖凝胶电泳检测结果看到。冻融法提取
（一）中得到的不吸水
链霉菌基因组ＤＮＡ看不到ＤＮＡ带，说明ＤＮＡ已经降解或者所提取的ＤＮＡ浓度很低，无法由电泳检测。冻融法提取
（二）中得到的ＤＮＡ可以看到清晰的ＤＮＡ带，但是还可以看到和基因组ＤＮＡ带浓度相近的
几条ＤＮＡ带，这说明所提取的样品纯度较低，有很多杂质存在，这将很大程度的影响ＰＣＲ扩增结果。分析原因可能因为把冻融法提取（一）中后面的亚精胺的纯化过程去掉以后，纯化过程减少，因而纯度降低，而且经过多次实验表明使用此方法提取不吸水链霉菌基因组ＤＮＡ时结果不稳定，每次提取的样品纯度各不相同，并存在降解的现象。微波法提取的基因组ＤＮＡ同样可以看到一条清晰的ＤＮＡ带，虽然纯度较好，但是浓度较低。另外，在提取基因组ＤＮＡ进行微波破壁的时候，所用的功率，时间等都有待进一步实验研究。溶菌酶破壁法提取的基因组ＤＮＡ可以看到一条很明亮的ＤＮＡ带，浓度很高，无其它的杂带显示，利用这种方法提取不吸水链霉菌基因组ＤＮＡ，ＤＮＡ稳定，浓度高，纯度好。
以不同方法提取的基因组ＤＮＡ做模板进行ＰＣＲ扩增后利用琼脂糖凝胶电泳进行检测，由结果可以看出，以冻融法（二）提取的基因组ＤＮＡ为模板进行ＰＣＲ扩增后无ＤＮＡ带显示，可能由于模板中杂质太多，影响ＰＣＲ反应，ＤＮＡ未能扩增，ＰＣＲ扩增反应失败。以微波法提取的基因组ＤＮＡ为模板ＰＣＲ扩增后有特异性ＤＮＡ带出现，但是浓度很低，影响回收、纯化，以至于酶切等实验研究。而以溶菌酶破壁法提取的基因组ＤＮＡ为模板ＰＣＲ扩增后显现明亮的ＤＮＡ带，特异性强，且浓度较高，可以用于回收、纯化、酶切等等实验，所以此种方法是一种高效的可直接用于ＰＣＲ扩增的不吸水链霉菌基因组ＤＮＡ提取方法。
（下转第２０２页）
２０２
生物技术通报ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＢｕｌｌｅｔｉｎ
２００８年第４期１１的幼胚，得到转基因水稻植株。对所得潮霉素抗性水稻植株的ＰＣＲ和ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ析表明：Ｏｓ９２２基因已经整合到受体基因组中。Ｔ１代转基因植株根的生长被葡萄糖所抑制，表现出对葡萄糖的敏感性，这一研究表明了Ｏｓ９２２基因可能与糖信号的传导有关。即可能说明Ｏｓ９２２在葡萄糖作用下，其信号传导起到正作用。其中叶绿素ａ降低，叶绿素ａ／ｂ的值比野生型低，说明超表达Ｏｓ９２２的转基因植株叶片叶绿素降低主要是由于叶绿素ａ减少所引起的作用。
秦春圃
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!（上接第１９７页）
参考文献
１２３４
徐平，等．微生物学通报，２００３，２０（４）：８２￣８４．徐平，等．中国抗生素杂志，２００３，２８（７）：３８８￣３９０．郑景生，等．分子植物育种，２００３，１（３）：３８１￣３９４．银国利，等．西北农业学报，２００３，１２（３）：１２￣１６．
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!中国科技核心期刊、全国优秀农业期刊
《植物遗传资源学报》征订启事
《植物遗传资源学报》是中国农业科学院作物科学研究所和中国农学会主办的学术期刊，为中国科技核心期刊、全国优秀农业期刊。该刊为中国科技论文统计源期刊、中国科学引文数据库来源期刊（核心期刊）、中国核心期刊（遴选）数据库收录期刊、中国学术期刊综合评价数据库统计源期刊，又被《中国生物学文摘》和中国生物学文献数据库、中文科技期刊数据库收录。据中国期刊引证研究报告统计，２００７年度《植物遗传资源学报》影响因子达０．９１４。
报道内容为大田、园艺作物，观赏、药用植物，林用植物、草类植物及其一切经济植物的有关植物遗传资源基础理论研究、应用研究方面的研究成果、创新性学术论文和高水平综述或评论。诸如，种质资源的考察、收集、保存、评价、利用、创新，信息学、管理学等；起源、演化、分类等系统学；基因发掘、鉴定、克隆、基因文库建立、遗传多样性研究。
季刊，大１６开本，１２８页。定价２０元，全年８０元。各地邮局发行，邮发代号：８２－６４３。国内刊号ＣＮ１１－
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